糖类化合物与强无机酸混合加热会脱水生成糖醛或其衍生物。这种物质 能与蒽酮、苯酚等物质缩合并显出颜色，常用来鉴别糖类。对轻基苯甲酸酰 肼（PAHBAH)法主要用于还原糖的测定，即分子中必需具有游离的半缩醛 羟基或具有a-羟基酮结构 试剂及仪器：
501型超级恒温器，上海市实验仪器总厂；
354 型 Multiscan Ascent 酶标仪，芬兰，LABSYSTEM 公司；
对经基苯甲酸醜肼(p-Hydroxybenzoic Acid Hydrazide，PAHBAH)购自 Sigma 实验方法：
PAHBAH 溶液的配制：取 0.5gPAHBAH 溶于 9.5ml 的 NaOH (5%) PAHBAH法测定还原糖标准曲线:分别在水解管中加入〇.5g/L的Glucose 标准溶液Ofil、5jil、10^1、30[il、4〇nl，并用双蒸水补至200叫。向上述水解 管中加入15O0PAHBAH溶液，再加入60〇nINaOH (5%)溶液，振荡混匀， 在120°C加热15min，用酶标仪在405nm下比色。
结果与讨论：
用酶标仪测定0~0.1g/L葡萄糖绘制标准曲线如图3-1所示，得直线方程 y=4.268x+0.149, R2=0.9973<,
图3-1还原糖标准曲线
Figure 3-1 The standard curve of reductive sugar 3.2黄原胶酶活力测定方法的建立
由于黄原胶溶液的粘度很大，其分子主链被水解则粘度下降，因此原则 上可以用底物溶液粘度下降速度来表示酶活力的大小。但是.由于黄原胶溶 液的假塑性很强，准确测定粘度的大小对粘度计的要很高=此外，测定粘度 所需样品的量相对较大。
因此，采用PAHBAH方法，选择用反应液中还原糖数量的增加速度来表 示酶活力的大小。黄原胶发酵液于9000rpm离心15min，取上清液作为酶液 按图3-2方法检测其活力。根据葡萄糖标准曲线，将两组〇D5〇4差值折算成 还原糖量，再根据酶活力单位的定义，算出黄原胶酶活力。
种子培养基的组分为：牛肉浸裔：0.3%,酵母浸音：0.1%,蛋白胨：0.5%, 葡萄糖：1.0%,水：98.1%，pH6.8〜7.0。
发酵培养基的组成为：黄原胶：0.45%,葡萄糖：0.08%,蛋白胨：0.1%, 酵母浸出粉：0.1%,水：99.27%, pH7.0左右。
黄原胶固体培养基的组分为：琼脂粉：2%，蛋白胨：0.1%,酵母浸出粉;
0.1%,黄原胶：0.3%,葡萄糖：0.2。/。，7K: 97.3%。
基础培养基组成为：黄原胶：0.45%, MgS04: 0.05%, K2HP〇4: 0.25%, NaCl: 0.1%,水：99.15%, pH7.0 左右。 实验方法：
将活化后的黄原胶降解菌按1% (v/v)接种量接种至装有100ml黄原胶 液体培养基的250ml三角瓶中培养，培养温度为301，旋转式摇床转速为 200rpm,培养过程中每间隔一定时间取样，分别测定发酵液的〇D62()、pH值、 上清液中的还原糖含量（P-Hydroxybenzoieacidhydrazide，PAHBAH 法）及 粘度。
结果与讨论：
图3-3发酵液参数的变化
Figure 3~S Fermentation diagram
将黄原胶降解菌XT-11接种于黄原胶液体培养基中培养，并测定培养过 程中的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变化，结果如图3-3所示。由于发酵 液的配比中加入了少量的葡萄糖加快了菌株的最初生长速度，当有还原糖(葡 萄糖）存在时发酵液的粘度没有下降，说明没有降解酶的出现。'发酵一天后, 发酵液中的葡萄糖耗尽，该菌株开始分泌降解酶降解黄原胶（现象反映为还 原糖的生成以及发酵液表观粘度的下降），有明显的二次生长现象，可断定 该酶为底物诱导型酶。此外，发酵液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度 的大幅降低，说明最先起降解作用的是主链降解酶（xanthase),伴随着还原 糖童持续升髙则说明了发酵液中侧链降解酶（xanthan lyase)的存在。而发酵 液的pH值在发酵过程中基本保持不变，只是在发酵后期略有上升。
图3-4发酵过程中pH随时间的变化 Figure 3-4 Change of pH in the process of fermentation
3.4发酵条件的优化
微生物产酶是个复杂的生理生化过程，不同的培养条件直接影响菌体的 代谢，从而影响酶的产量，因此，对发酵产酶条件进行优化是提高产酶量的 前提。
试剂与仪器：
AEG-120电子分析天平，日本，岛津公司；
7901型磁力搅拌器，上海华光仪器仪表厂；
4330型pH计，英国，JENWAY公司；
对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH)购自Sigma, USA;
其他试剂为国产分析纯试剂
3.4.1氮源对发酵的影响：
首先考察了氮源物质对发酵产酶的影响，向基础培养基中加入1%的7 种不同种类的氮源，培养72小时后，测定菌体生物量及酶活（见表3-1)。 从表3-1中可以看出，硝酸铵发酵水平较高，而且来源容易，因此选其作为 发酵培养基的氮源物质。
表3-1氮源对菌体生长及产酶的影响
Table 3-1 Effects of nitrogen sources on the bacterium growth and xanthase production
氮源生物量（OD620)酶活/UJ.I/1
酪蛋白0.39760
蛋白胨0.333104
尿素0.32422
硝酸铵0.452338
硫酸铵0.42161
硝酸钠0.33855
氯化铵0.33628
3.4.2碳源对发酵的影响：
向基础培养基中加入1%的硝酸铵及1%不同种类的碳源，培养72小时
后，测菌体生物量及酶活，表3-2表明，葡萄糖效果最好。
表3-2碳源对菌体生长及产酶的影响
Table 3-2 Effects of carbon sources on the bacterium growth and xanthase production
碳源生物量（OD620)酶活/IUU1
葡萄糖0.572m
蔗糖0,33387
D-木糖0.347217
乳糖0.452188
异麦芽糖0. 247112
海藻酸钠0,511319
阿拉伯胶0.3380
D-果糖a 499282
D-甘露糖0.32952
棉子糖0.422245
3.4.3初始pH值对菌体生长及发酵产酶的影响：
6-
值
PH
用HC】和NaOH调节发酵培养基的pH，灭菌后用同一制备的菌悬液接 种，考察了上述优化确定发酵培养基初始pH值分别为6、6.5、7、7.5和8 时发酵液的黄原胶酶活性及菌体密度，结果显示（图3-5)初始pH 7.0时发 酵液产生的黄原胶酶活性最高，菌体密度也达到最大，因此发酵过程应该在 中性条件下进行。
图3-5 pH对菌体生长及产酶的影响
Figure 3-5 The effects of pH on the growth and enzyme production
3.4.4通气量对菌体生长及发酵产酶的影响：
在250mL三角瓶中分别加入不同体积的培养基，各接1%种子液，在 30°C，pH 7.0, 200 r/min培养72小时后，测定各发酵液的酶活及菌体密度。 结果显示（图3-6)，摇瓶装液量为30mL时其发酵液的酶活以及菌体生物量 达到最髙，因此可以确定最佳摇瓶装液量为30mL。
图3-6通气量对菌体生长及产嗨的影响
Figure 3-6 The effects of aeration on the growth and enzyme production
3.4.5温度对发酵产黄原胶酶的影晌：
分别考察了 25°C、30°C、35°C培养温度下发酵液黄原胶酶活力隨时间的 变化规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL，初始pH为7.0,接种量为]%, 摇速为200r/min。结果可知（图3-7)在发酵温度为3(TC时酶活最高。
3.4.6温度对菌体生长的影响：
分别考察了 25°C、3(TC、35"C培养温度下发酵液菌体密度随时间的变化 规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mJU初始pH为7.0,接种量为1%， 摇速为200 结果可知（图3-8)在发酵温度为304C时可获得最大菌体 量。
3.4.7底物浓度对发酵产黄原胶酶的影晌：
考察了底物浓度分别为0.5%、1%、1.5%时发酵液黄原胶酶活力随时间 的变化规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL,初始pH为7.0,接种量 为1%,摇速为200 r/min。结果可知（图3-9)在底物浓度为1°/〇时酶活最高。
按不同接种量将不同种龄的液体种子接入发酵培养基中，〜24h的种 子产酶较髙，而接种量的影响不大。
3.4,10菌株XT-11产黄原胶酶的正交试验:
根据摇瓶中单因子试验的结果，设计四因素三水平正交试验确定XT-11 发酵产酶的最佳条件。根据正交试验分析(如表3_3), XT-11菌株产酶的最佳 条件是：培养温度309C，起始pH为7,底物浓度为1%。其中影响最大的是 生长温度，其次是底物浓度与装瓶量，pH影响最小。
表3-3正交试验结果
Table 3-3 Result of orthorhombic testing
实验组温度(°c)pH装童（mL)底物浓度酶活力OJ/mL)
1256300.50%0.3145
2257501%0. 4227
3258751.50%0. 4578
4306751%0. 5031
5307301.50%0. 4557
6308500.50%0, 3698
7356501.50%0.30]
8357750.50%0.3145
9358301%0. 2944
K】1.221. 151.091.03—
K21.331.19L091.22—
K30.911. 121.281.21—
R0.420.070.190.19—
3.S黄原胶寡糠的制备
多聚糖降解制备寡糖的方法主要有三种，即化学降解法[2]、物理降解法[3] 和生物酶降解法[4]。化学法由于不易控制，降解产物为价值不大的单糖，得 不到所需的低分子量寡糖，且对环境污染严重，己逐渐被淘汰。物理降解法
主要是利用电磁辐射使糖苷健断裂而产生低聚糖，它需要有一套具有髙辐射 强度的电离辐射设备和相应的防护设施，目前仅处于实验室研究阶段，实际 应用具有一定的局限性。酶降解法具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成 环境污染等优点。它不仅可以获得低聚寡糖，而且容曷控制寡糖的聚合度， 是低聚糖制备的方向。 试剂与仪器：
对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH)购自Sigma, USA;
其他试剂为国产分析纯试剂；
4330型pH计，英国，JENWAY公司；
GL-21M髙速冷冻离心机，湘仪离心机厂；
QHZ-98A全温度振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；
BIOSTAT发酵罐，德国，Heidolph公司
实验方法：
将培养3-4天的发酵液（以培养液的粘度大幅度降低为根据)在9000rpm， 41：条件下离心15分钟以除去菌体，留上清液备用。黄原胶溶于磷酸盐缓冲 液（60mmol/L，pH=5.9 )中配成2%Xanthan Gum潜液。将上清液作为粗酶 液与2%Xanthan Gum溶液于30"C恒溫摇床中保温酶解。选取不同的时间终 止酶解反应，测溶液粘度、生物量、还原糖三项指标。在9000ipm，4T：条件 下离心15分钟以除去菌体，用Sevag法除去蛋白[SI,经乙醇洗涤后浓缩冻干 可得粗寡糖。
结果与讨论：
为了确保降解充分，首先选取粗酶液与底物浓度5: 1的比例进行反应。 结果发现（图 >】丨），24小时底物粘度下降98%,同时还原糖含量达到最高， 而菌体密度在降解的过程中随时间的推移不断的增长。
图3-〗]黄原胶降解参数曲线I Figure 3-11 Diagram curve of xanthan degrading I
在对第一次酶解参数进行分析的基础上，对粗酶液与底物浓度的配比进 行了调整，降低到了 1: 1进行第二次酶解分析。第二次酶解结果（如图M2) 显示出了与第一次相类似的特性。42小时底物粘度下降99%以上，同时还原 糖含量达到高峰，菌体密度随着酶解的进行不断增长。可见，在第二次酶解 条件下，虽然酶解时间增长了近一倍，但却大大节省了酶液的用量，因此这 个条件更有利于黄原胶寡糖的制备。