光学显微镜的出现使得我们能够观察到用肉眼看不到物质细节，如生物细 胞，因此它在生物学研宄中已经成为一个必不可少的重要工具。普通的光学显微 受到衍射极限的限制，不可能分辨比A/2(A为光波波长)更小的物体，普通的光学 显微镜分辨率的极限只能达到0.3 #。后来发明的电子显微镜虽然具有非常高的

分辨率，但它复杂的制样要求限制了其在活性生物分子等方面的研宄应用。到了 二十世纪八十年代，Binnig和Rohrer[1]发明了扫描隧道显微镜(scanning tunneling microseope，STM)，使人们可以观察原子级微观世界，但是其适用范围有限。 1986年诞生了原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM) [4]，这种高分辨的

扫描探针显微镜能够应用到包括绝缘体样品在内的各种样品研究中。

2.1.1原子力显微镜的工作原理

原子力显微镜(AFM)是Binnig等人在STM的基础上发明的，它利用原子之 间的范德华力（VanDerWaals Force)来呈现样品的表面特性。

原子力显微镜有一个对力非常敏感的微悬臂，其尖端有一个微小的探针，当 针尖与样品表面接触的时候，针尖与样品表面上的原子之间存在有一个非常微弱 的相互作用力而使微悬臂弯曲，将微悬臂弯曲的形变信号转变为光电信号并进行 放大，就可以得到原子之间力的微弱变化的信号。AFM通过测量探针针尖与样品 表面原子间力的大小来描绘出样品的表面形貌，它不受样品是否具有导电性的限 制，可以测量导体、半导体和绝缘体，因此AFM的出现补偿了 STM不能观测绝 缘体的缺陷，为生命科学领域的发展做出了很大的贡献。图2-1为AFM工作原 理及仪器结构示意图。

图2-1 AFM工作原理示思图 Fig.2-1 Schematic of working principle of AFM

2.1.2原子力显微镜的工作模式

根据扫描方式的不同，AFM成像有两种模式，一种是恒力模式，一种是恒高 模式。在扫描的过程中，恒力模式的探针与样品表面之间的相对距离保持不变， 即是原子间的作用力保持不变，如图2-2(a)，恒高模式是保持探针针尖的高度 保持不变，如图2-2(b)。

图2-2 AFM的两种探针扫描方式:a)为恒力或恒流方式，b)为恒高方式

Fig.2-2 Schematic diagram of two operating modes of AFM: a) constant force mode,b)constant height mode

根据原子间之间的作用力（引力或斥力）的不同，AFM成像模式又分为接触模 式(Contact mode AFM，C-AFM)、非接触模式(Non-Contact mode AFM，NC-AFM)

河南大学光学专业2006级硕士论文

和轻敲模式（Intermittent-contact(tapping mode) AFM，TM-AFM)三种工作模式，如

图2-3。

Contact. ModeNoncontact. ModeT appinp Mode

rf -

1 0

Elesuiting image profiles

图2-3AFM工作模式和得到的形貌轮廓a接触模式b非接触模式c轻敲模式 Fig.2-3 AFM working modes and resulting image profiles.a) contact mode，b) non¬contact mode c) intermittent-contact(tapping mode)

接触模式中，针尖和样品表面之间的距离是几个埃，针尖与样品之间的作用 力在范德华力的排斥区域内。非接触模式中，针尖与样品表面之间的距离是50- 100埃，针尖与样品之间的作用力在范德华力在吸引力区域内。当针尖与样品之 间的作用力在范德华力的吸引力和排斥力区域之间的时候，此工作模式被称为轻 敲模式，针尖与样品表面之间的距离大约是10-50埃。图2-4为原子间的 Lennard-Jones曲线，在图中我们可以看出有三个区域：（1)接触区域，代表的是 AFM接触模式;2)非接触区域代表AFM非接触模式；3)在接触区和非接触区两 者之间区域，代表TM-AFM模式。

接触模式下，针尖前端的单个原子与样品表面的单个原子之间存在排斥力， 敏感的微悬臂因为排斥力发生弯曲。利用这一点可以测量出原子间接近时的相互 排斥力，一般可以测得两个原子之间的力为1〇-8N左右。接触的情况下由于摩擦 力的存在可以引起悬臂的偏转，不同的摩擦力使悬臂的偏转不同，运用该特点可 以来检测针尖与样品表面之间摩擦力的大小，一般可以测得摩擦力的大小1〇-11N 左右。由于针尖与样品的接触比较近，成像的分辨率高。但是如果扫描的样品比 较软的情况下，针尖和样品表面强的排斥力会造成样品原子位置的改变，引起软 样品的损伤；同时，软样品的原子容易粘附在探针针尖上，污染针尖不利于成 像，所以接触模式下一般不对软样品进行扫描，研宄生物大分子、低弹性模量样 品以及容易移动和变形的样品不能用接触模式。

非接触模式下针尖与样品表面表面之间是不接触的，相互作用力也比较小。 这样小的力有利于研宄软的或生物样品。但此时针尖与样品之间的距离较远，分 辨率要比接触模式和轻敲模式都低，而且成像不稳定，操作相对困难，在生物中 的应用也比较少，此模式一般比较少用。

处在两者之间的被称为轻敲模式(Tapping mode AFM，TM-AFM)。轻敲模式 类似于非接触模式，只是轻敲模式下的微悬臂的共振频率的振幅振动比较大，一 般在20nm左右，AFM的针尖在振荡的时候与样品的表面只是轻轻接触，因此被 称作轻敲模式。由于轻敲模式能够避免针尖粘附到样品上，以及在扫描过程中对 样品几乎没有损坏，针尖与样品的剪切力更小，对样品的损伤也更小，所以在液 体中的轻敲模式成像可以对活性生物样品进行现场检测、对溶液反应进行现场跟 踪等。

在空气中进行成像的时候，对于一般的无机材料等刚性物质，一般采用接触 模式。对于生物样品、软的或弹性样品，通常采用用非接触模式或轻敲模式，原 因如下：（l)扫描时针尖一样品间作用力较小，且消除了侧向力（如摩擦力和拉 力），不会使样品变形，可以进行自然状态的观察；（2)当空气中的湿度较大时 (RH>65%)，样品表面会形成一层水膜，并且这层水膜对针尖的毛细作用力远超

过其它作用力，它会使AFM图像变形或者不能成像，从而严重影响成像的分辨 率。在非接触模式或轻敲模式中，毛细作用力对针尖的作用明显减小，对图像影 响较。在我们进行试验的时候经常采用的是轻敲模式。

在近生理溶液中成像，一般采用用接触模式模式。因为近生理溶液中不存在 毛细作用力的影响，因而接触模式能很好地控制针尖与样品间的相互作用力。倘 若在溶液中用非接触模式，针尖所施加的侧向力虽然减小，但是溶液的存在使得 探针在不接触样品时难以测得准确的高度值，在形貌成像中，分辨率非常差。另 外，非接触模式很容易引起液体的波动，导致分辨率降低。近期来已经发展的一

种新型轻敲模式磁驱动轻敲模式（MAC )，他的工作原理是通过交变磁场

来直接驱动背面镀有磁膜的微悬臂，可以很大的提高轻敲模式的实效性，特别是在 液体情况下，它可以实现对微悬臂的非常精确的控制，在扫描成像中，可以使用力 常数更小的微悬臂及更小的驱动力，因此大大提升了轻敲模式在生理环境下对生 物样本成像的优势。我们实验中采用了磁驱动轻敲模式成像，并得到了很好的成 像效果。