丝素蛋白膜具有无毒性、无刺激作用、透湿性好等许多优异性能，作为生物材 料具有广阔的前景，可用于研制人工皮肤来修复、治疗烧伤、烫伤等患者【1]。在以 上四章中，已对共混膜的物理性能进行了研究，可知反应时间在1.5h、反应温度 在3(TC-5(TC、在丝素含量大于50%时，所得尿素共混膜的性能较好。本章中对

这些条件下得膜，来进一步研究。

医用的生物材料要直接接触人体组织细胞或血细胞，所以必须考虑到其生 物安全性。材料血液相容性的评价方法为采用体外培养细胞方法评价生物材料的 细胞毒性以及用血检测生物材料的血液相容性，这已被认为是一种有效的检测技 术。溶血试验除了作为血液相容性评价的试验之一，还作为急性毒性的一个体外 筛选试验，在生物安全性评价中起着重要的作用。对于材料的血液相容性，由于 其影响的因素很多，机制复杂，涉及血液学、工程材料和材料科学的广泛领域。 所以对于“血液相容性”的测试，没有具体的标准化，对不同的材料具体的结果 也不一样的。但有不少学者将抗凝血性、不坏血液成分及不改变血液生理环境 的特征定义为材料的血液相容性P]。六十年代初，美国国家卫生研究院（NH)幵 创了血液相容性的试验评价方法实验。之后，发展出来很多种评价材料的血液相 容性的方法。总的来说，这些方法可以归纳为体内法' 半体内和体外法三种(见表 5-1)。

表5-1生物材料的血液相容性评价实验

环境试验方法检测目的方法的优缺点

体内将材料植入体内， 观察材料表面的血栓形成 情况，材料的变化以及在 体内各部分位产生的微小 血检组织结构变化。在机 体方面，还观察血小板等 血液成分的损伤。动物试 验。在接近使用状态的 条件下，综合评价材料和 机体两方面的变化和程 度，弄清数周、数月间 BM1的状况。（血液和材 料的相互作用Blood — Material Interaction,简 称 BMI)实验接近材料的使 用条件，结果具有准确性 和真实性。但手术复杂、 时间长、不易定性、定量 分析。痛时，由于动物使 用的体系和人有差异，常 造成自相矛盾的实验结 果。

半体内在体外的血液分流 回路中设置试验腔，观察 试验材料表面血浆、血小 板、红细胞数量的以及结 构、形态的变化和血栓形 态等B动物试验。在与使用状态大致 相近的条件下，测定材料 表面与血液的反应性，尤 其是血栓本身的生成程 度，弄清数天间BMI的 状况。二次筛选。与材料使用条件较 接近。速度快、灵敏度 髙，接近临床实验。

体外让血液和材料接 触，观察材料表面的血浆 蛋白、血小板、白细胞、 红细胞等的数量及其结构 形态的变化。另歼，还观 察血液中凝血因子的变 化。血液为人或动物血测定材料表面与血 浆蛋白、血小板、白细 胞、红细胞等的反应程 度，弄清BM1的初期状

况初筛。灵敏、快速及经济 的特点。易受环境影响， 准确性差

_ _

本章釆用体外试验法测定了共混膜的体外溶血试验、复钙试验和血小板扩张 试验。用快速、敏捷而又经济的方法体外法对共混膜的血液相容性进行比较研 究，研究材料在血液相容性方面的效果。

5.1实验 5.U实验材料

各试样号及组成为：1#纯丝素蛋白膜；反应时间为1.5 h、反应温度为3(TC 下制得的共混膜:2#样，丝素/竣甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、3#样尿素(10%)/丝素 /竣甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、4#样尿素(20%)丝素/竣甲基纤维素钠 (FM6)(80/20)膜

5丄2实验方法

实验由暨南大学生物医学工程研究所完成。实验采用的血样为医院血液中心新鲜 抗凝血。

5.1.2.1溶血试验【34]

原理：将试样与血液直接接触，测定红细胞释放的血红蛋白量，以检测试样 体外溶血程度。血红蛋白的吸收波长为545纳米，可用分光光度计(上海棱光722s 分光光度计 > 检测其浓度。

实验方法：

1.所用玻璃试管和其它与血液接触制品统一硅化处理。试样切成Icmxlcm的块 状。

2.取抗凝血8毫升，加0.9%氯化钠注射液10毫升稀释。

3.取硅化试管，分别装试样和氯化钠注射液1〇毫升、蒸馏水1〇毫升。

4.全部试管在37度水浴中恒温30分钟，分别加(U毫升抗凝血，并在37度保温

60分钟。'

5.1200转离心3分钟，取试管上层清液，在545纳米波长处测定吸光度。溶血率

如下式计算，

溶血率 a (%〉^Ds~Dnx\m

Dp-Dn

式中：Ds，试样平均吸光度；Dn,阴性组吸光度；Dp，阳性组吸光度。

6.溶血率小于5%的为合格。

5X2.2复钙试验

该试验是测试试样阻止血浆白蛋白与钙离子结合作用的能力&

试验步骤：

1.按一份防凝剂的草酸钠溶液）加9份血液的比例混合，制成防凝 血。直接取抗凝血，在离心机上以1〇〇0转/分的速度离心10分钟，取上层富含血

小板的血清。

2.将待测试样剪成约1厘米见方的方块，置于小试管中，加入0.1ml富含血 小板血浆，37度水浴恒温让试样与血液接触1小时，再加入37度0.5%的新配置 氯化钙溶液0,1ml，立即计时，不断轻轻摇动试管，至出现白色纤维蛋白膜时，

记录所需时间。

5.1,2.3血小板扩张试验

该试验是通过测试血小板与材料表面相互作用，探讨材料对血小板的相容性。

试验方法：直接取抗凝血20ml，以1000转/分的速度离心分离5分钟，取上清 液以1: 4.5的比例加稀释液（9份生理盐水加1份2%草酸钾配置），制成富含 血小板的血浆。用此血清37度下恒温接触材料30分钟，然后用稀释液冲诜三 次。2,5%戊二醛固定30分钟后，依次用CUM磷酸置换三次，每次10分钟，用 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇各脱水一次，每次10分钟，醋酸异 戊酯置换三次，每次5分钟，干燥后置于扫描电镜(Hitachi S520/ISIS-300)下观察 材料表面上血小板粘附情况。

5.2实验结果与讨论 S.2.1溶血率

溶血率的实验结果列于表54中，不同材料的溶血率见表5-U各种材料的溶 血率由小到大的顺序排列为：3#<2#<4#<1#。溶血率的大小反映了材料对红细胞 造成破坏引起溶血的程度，以溶血率指标评价各种试验材料的血液相容性，溶血 率小于5%的为合格。从实验结果来看，材料的溶血率都小于5%，所以共混膜都 为合格。但具体的膜的血液相容性还存在差别，反应时间为1.5h，反应温度为 3(TC下制得的共混膜=2#丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、3#尿素(10%)/丝素， 羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20>膜最好，1#纯丝素膜、4#尿素(20%)丝素/羧甲基纤维 素钠(FM6)(80/20)膜次之。结果表明，用适当的尿素变性剂改性，能有效的改善 材料的溶血率。

表5-1各种材料的溶血率实验数据

样品号1#2#3#4#

溶血率(％)2.8%KS%1.3%2.0%

5.2.2复钙时间

复妈试验的实验结果列于表5-2中，不同材料的复钙时间见表5-2。各种材料 的复钓时间由大到小的顺序排列为：3#〉2#> 1#。复钙时间的大小反映了材 料对红蛋白纤维的沉淀作用，复钙时间越长，证明材料对蛋白纤维的沉淀作用越 小。以复钙时间指标评价各种材料的血液相容性，对反应时间为15 h、反应温 度为30°C下制得的共混膜：4#尿素(20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜最 好，2#丝素傲甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、3#尿素(10%)/丝素/羧甲基纤维素钠 (FM6)(80/20)膜次之，^纯丝素膜最差■■结果表明，用适当的尿素变性剂改性| 能有效的改善材料的复钙时间。

表5-2各种材料的复钙实验数据

样品号1#2#3#4#

复钙时间(秒）20025Q282300

5.2.3血小板扩张试验

血小板扩张试验的实验结果列于表5-3中,不同材料的血小板扩张试验的扫描 电镜图见图5-1。血小板扩张试验的实验反映了血小板与材料表面相互作用，材料 对血小板的相容性。以血小板扩张试验指标评价各种材料的血液相溶性，血小板 粘附情况表明，对反应时间为1.5h，反应温度为30°C下制得的共混膜:3#尿素 (10%)/丝素/竣甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜对血小板黏附太多，不是理想的材 料；4#尿素(20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、2#丝素/羧甲基纤维素钠 (FM6)(80/20)膜和1#纯丝素膜是理想材料。

表5-3各种材料的血小板扩张试验的实验结果与扫描电镜图

样品号1#2#3#4#

血小板粘附■血小板很少 (10微米左右）、 无明M变形、表 面均质比1#粘附稍

多，放大后无填 充物粘附血小板 多，但变形不明 显粘附血小板很少

3#4#

图5-1血小板扩张试验的扫描电镜图

S.2.4各种材料血液相容性的综合评价

通过以上三个指标的测定，由单个指标初步评价了各种材料的血液相容性的 优劣。但同一材料的血液相容性指标不—定匹配，主要是测试的作用机理不—

样，影响因素繁多。通过这些测试结果的综合分析[53,可大致确定理想材料的范 围。本实验中可确定理想材料为反应时间为1.5 h，反应温度为30X：下制得的尿 素(10%-20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜。

S.3小结

(1)通过溶血率实验测试得出，反应时间为L 5 h,反应温度为3(TC下制得的 共混膜:丝素/竣甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、尿素(10%)/丝素/羧甲基纤维素钠 CFM6)(80/20)膜的血液相容性最好。

(2)通过复钙试验得出，反应时间为1. 5 h,反应温度为30°C下制得的共混膜: 尿素(20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6X80/20)膜的血液相容性最好。

(3)通过血小板扩张试验得出，反应时间为1. 5 h，反应温度为30°C下制得的 共混膜：尿素(20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(80/20)膜、丝素/羧甲基纤维素钠 (FM6)C80/20)膜和纯丝素膜是理想材料。

(4)综合考虑可确定理想材料为反应时间为1. 5 h，反应温度为30°C下制得的

尿素(10%-20%)丝素/羧甲基纤维素钠(FM6)(8〇/2〇)膜。

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