由木醋杆菌合成的细菌纤维素化学组成上与植物纤 维素相同,但与植物纤维素相比，具有纯度高、结晶度高、 重合度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强等独特 的性质[1]。目前国外通过改变生物合成环境下的物理、 化学或生化条件来改变纤维素装配的高度序列结构及其 产量，即在细菌纤维素发酵的培养基中添加一些物质（如 荧光增白剂）阻碍正常丝带装配并改变了产物的晶体结 构和性质[2];半纤维素影响纤维素分子的晶体结构及形 状[3];水溶性多糖（琼脂[4]、acetan[5]等）阻碍大团块的纤 维素的生成，增加溶氧从而提高产量;木素磺酸盐影响静 态培养条件下BC产量、晶体结构和物理性质[M]等。由 于细菌纤维素在动态条件下存在严重结团和菌株逐级放 大后生产稳定性差的2大难题,导致产量较低，而添加羧 甲基纤维素钠能有效解决，故本研究主要考察^^〇6〇〇时 NUST4. 1在动态条件下添加竣甲基纤维素钠对细 菌纤维素产量的影响，并探讨采用动静二步发酵法进一 步提高纤维素产量。

　　

　　1材料和方法 1.1实验材料AcetoiacterNUST 4_ 1:由本实验室筛选并保藏。

　　

　　固体培养基:葡萄糖3.0%,蛋白胨1.0%,柠檬酸 0_ 115% ,碟酸氢二钠0• 27% ,硫酸镁0• 025% ,琼脂2.0%， pH 6.0;种子培养基:葡萄糖2.0% ,玉米浆干粉0.6% ,硫酸 铵0.6% ,鱗酸二氢钾0• 1% ,硫酸镁〇• 04% ,PH 6_ 0;发酵培 养基:葡萄糖1. 8% ,蔗糖2.1% ,玉米浆干粉2.0% ,硫酸铵 0.4%，醋酸0.06% ,磷酸二氢钾0• 2% ,硫酸镁0.04%，pH 6.0。发酵罐中需加消泡剂0_ 05mL/L。

　　

　　1.2实验方法摇瓶培养:种子培养基中接入斜面菌种后，于28T、 15〇r/min振荡培养18h,按8%接种量接种于发酵培养液 中，于29丈、180r/min振荡培养5d,其中向发酵培养液中添 加不同浓度的 CMC-Na(0.02%、0.04%、0.06%、0• 08% ), 平行实验3组。

　　

　　发酵罐培养：种子培养基中接人斜面菌种后，于 (28 ± 1 )丈、150r/min振荡培养18h,按8%接种量接种于经 原位灭菌的添加了 0.06% CMC-Na的发酵培养基中，在机 械揽拌发酵罐（比欧L1523,瑞士）中实验,调整搅拌转速 300r/min,培养温度（28 ± 1)尤，罐压0.03MPa,通气量 0.5iy(L.min),平行实验3组。

　　

　　1.3分析方法pH值测定:使用PHS-2型PH计;菌种变异情况测定： 发酵液稀释涂布看菌落形态;残还原糖测定:改进的DNS 法[8];纤维素产量和菌重测定:参照参考文献[9^2结果与讨论2.1添加CMC-Na对摇瓶条件下产细菌纤维素的影响考察添加不同浓度的CMC-Na对摇瓶培养收稿日期:2〇〇8"〇3-12作者简介:孙东平U970-),男，江苏连云港人,副教授，研究方向为微生物生理生化及应用。

　　

　　NUST4. 1产细菌纤维素的影响，结果见图1。添加 0.06%羧甲基纤维素钠较佳，其纤维素产量是未添加时的 1.94倍，产量提高非常明显，而且改变了细菌纤维素在发酵 液中的形状，由大团块变为大小不一的小团块分散于发酵 液中，根据pH值变化可知添加适量CMC-Na能调节pH值， 但当其浓度达一定程度时，因发酵液初始黏度增加而抑制• 42 •2008 No. 24 Serial No. 201China BrewingResearch Report细胞生长，致使纤维素产量下降，究其原因可能是羧甲基纤 维素钠是可溶性的，与纤维素具有一定的亲和力，在水溶液 中带一定电荷，在NUST4_ 1吐丝过程中 被吸附到微纤丝表面，阻止这些微纤丝的团聚，另外其还可 通过物理交叉联结引起氢键变化，导致纤维素形态发 生变化[1°]。

　　

　　图 2 300r/min、1.0L/( L.min) (12h 前丨、〇• 75L/( L.min) (12h 后）组合的发醇过程变化Figure 2. Fermentation dynamics in the determined conditions 考察添加 〇• 06% CMC-Na 对 yketofcackr NUST 4.1在发酵罐中产纤维素的影响（见图2)。发酵 罐中未添加0.06% CMC-Na时，发酵液中纤维素分布不 均匀，易结团，并缠绕在发酵罐的内部零件（如pH电 极、溶氧电极、温度传感器、取样管、搅拌轴、通气管）上， 而发酵液极为清澈，致使营养物质和溶氧传质不均而限 制团块中菌体细胞生长，导致细菌纤维素产量难以提 髙；当添加0.06% CMC-Na后，上述的结团和缠绕现象 消失了，呈均勻的絮状悬浮物，原因是改变了发酵液的 流变学性质，有利于细胞充分利用营养物质生长，产量 是未添加的1.95倍，效果与摇瓶培养吻合，但相比于摇 瓶条件下的低很多，原因是发酵罐中搅拌强度和溶氧比 摇瓶中大，使得细胞较摇瓶中生长更旺盛，而代谢能力 变弱，另外所产的纤维素的形状两者也不同，在发酵罐中 纤维素絮状体的产生导致发酵液的黏度较摇瓶更大，黏 度在一定范围内有利于细胞生长,但黏度太高反而不利 于细胞利用底物，进而抑制生长。

　　

　　2.3分批发酵培养的工艺条件确定采用添加〇. 06%羧甲基纤维素钠的优化培养基考察发 酵罐参数(搅拌转速、通气量和过程中pH值的控制）对 i4ceto6acter;ic；yZiniwn NUST4.1产纤维素的影响，以期进一步 提高纤维素产量。

　　

　　2.3.1搅拌转速和通气量的确定根据文献调研和预实验，确定考察发酵罐的不同转 速和不同通气量：转速200r/min ~ 500r/min，通气量 0.25L/(L.min) ~1.0L/(L.min)。根据均匀设计表安 排实验条件见表1。实验过程中发现组合1延滞期较 长;组合2的延滞期很短，纤维素在48h前随菌体生长 持续增加，48h后趋于平稳;而组合3延滞期不长，纤维 素随菌体生长持续增加，但其更利于菌体生长，纤维素 生成稍差些，从放罐时稀释涂布发酵液发现有2种菌落 存在，一种为正常菌落，即表面光滑、易挑取、乳白色、粒 状、干的小菌落，镜检为均匀细短杆;另一种为变异菌 落，即表面粗糙、白色、难挑取、湿的大菌落，镜检为长粗 杆，与文献[11]报道一致;组合4过程中发现纤维素以更 细的絮状物形状分散于发酵液中，发酵液最粘稠，现象 同组合3。后结合实验，当采用12h前设定搅拌转速 300r/min，通气量1.0iy(L‘min),12h后调整通气量为 0.75L/(L.min)，转速不变时，纤维素产量为2.89&/L，产 率别表1实验条件的安排和结果Table 1. Arrange of experimental conditions and results组合转速/(r.min’1 )通气量/[L*(L*min)]纤维素产量/ (g.L】）产[g*(L-h)'']12002(0.5)1.290.01223004(1.0)1.810.03834001(0.25)1.140.02445003(0.75)1.570.0312.3.2过程中pH值的确定由于培养液的pH值对细胞生长和细菌纤维素的合成 有很大影响[12],因此控制pH值有望提高纤维素。表2反 映了控制不同过程pH值时发酵参数的比较，从中可发现分 段控制时的纤维素产量、产率、转化率都较高，发酵时间相 对较短，最终的菌重适中，当pH值控制在4.5时，其发酵周 期最长，导致产率较低，当pH值控制在5. 5时，其菌重最 高，纤维素产量和转化率较低，说明该pH值适合菌体生长, 不利于纤维素的积累。

　　

　　3结论羧甲基纤维素钠是一种水溶性多糖,添加到发酵液 中能改变发酵液的流变学性质——黏度,能影响/tceto* 6octo•町心mm NUST4. 1的生长进而影响细菌纤维素的产 量。结果表明，添加〇• 06% CMC-Na能有效解决发酵罐 中严重结团和菌株逐级放大后生产稳定性差的2大难 题，而且能显著提高纤维素产量,优化发酵罐基本工艺 (添加0• 06%羧甲基纤维素钠作为发酵罐培养基;搅拌转 速30〇r/min, 12h前控制通气量为1.017(L_min), 12h后调 整为0• 7517( L.min)开始不控制pH值，当pH值下降为 低于5.0时，通过蠕动泵滴加10% NaOH溶液控制pH值为 5. 〇),由此能获得3.35g/L干纤维素，产率为0.08g/(L.h), 是基础培养的3.1倍。