寡糖（Oligosaccharides) —般是指由3〜10个分子的单糖组成的聚合物。 在自然界中，寡糖类与蔗糖、麦芽糖和乳糖等一般双糖类不一样，很少以游 离状态存在。寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内，是重要的信息物质， 参与多种生命活动。寡糖由于单糖分子、结合位置和结合类型的不同，种类 繁多，功能各异，有着多种重要的生物活性。

1.1.1胃肠道活性

纯寡糖是寡糖类化合物中结构最简单的一类寡糖，但其却具有许多重要 的生物功能。纯寡糖(如乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、异麦芽糖、半乳糖寡 糖等)可作为一种促双歧杆菌生长因子（bifidus factor，BF)[1]。所谓促双歧杆 菌生长因子是指能促进双歧杆菌生长繁殖的一大类天然及合成物质，能提高 人体免疫力，使肠道内pH值下降，抑制肠道有害菌生长，产生B族维生素， 分解致癌物质，促进肠蠕动及蛋白质吸收。已知的这类物质约有20多种，半 乳糖寡糖(Galacto-oligosaccharide, GOS)就是其中最具有代表性的一个。 Shuichi Yanahara等[2]通过双岐杆菌培养实验和动物实验证实了 GOS具有高 效、专一地促进双歧杆菌生长，改善动物肠道内菌群分布，促进钙的吸收， 提高食物转化率，降低血清胆固醇含量及盲肠内pH值等生物活性。人体摄 入适量的BF可以促进双歧杆菌的增值并增强其活性，有益于调整微生物群 落的分布。

除此以外，天然的纯寡糖还有其它如供能、预防蛀牙、降低血脂及促进 矿物质吸收等十分重要的功能[3]。大豆低聚糖有拮抗机体过氧化损伤及降脂

1

作用。果寡糖（fruco-oligosaccharide)饮用后钙、铁、镁的吸收率均有上升趋

势。基于纯寡糖的上述功能，人们已开发出许多寡糖类保健食品。

某些纯寡糖也有一定的副作用，如大豆低聚糖中的棉子三糖和水苏四糖 不能被胃和肠上段的消化酶消化，而被结肠中的细菌发酵产气，引起肠胃胀 气，被称为大豆胀气因子，是大豆的抗营养因子之一[4]。

1.1.2增强造血功能活性

中药具有纯天然、副作用低等优点，但成分复杂，作用机理不易阐明， 使得中药难以得到国际公认。目前，生物学家们主要通过提取中药中的有效 成分来改变这种状况。糖类作为中药中普遍存在的成分，成为中药有效成分 研究的关键对象之一。近几年从中药中提取出的寡糖有效成分有很多，其中 地黄寡糖、甘草及巴戟天中的寡糖研究尤其引人瞩目。

地黄低聚糖（rehmanniaglutinosa oligosaccharide，RGOS)，是从地黄多糖 中进一步分离提取的有效成分。实验研究证明，GROS可以使快速老化模型 小鼠（SAMP8)的CFUS、CFU-GM和GFU-E明显增多[5]，并且可以使外周 血中降低的WBC数明显增加。由此提示GROS可刺激SAMP8小鼠造血干 细胞、主细胞的增殖分化。集落刺激活性实验显示GROS可使小鼠体内的集 落刺激因子产生明显增多。小鼠骨髓组织学研究结果也进一步证实了 GROS 可增强SAMP8小鼠造血功能的作用。上述这些实验结果揭示GROS可以增 强SAMP8小鼠的造血功能。此外，GROS对实验性糖尿病高血糖大鼠糖代 谢尚有调节作用。

1.1.3促有丝分裂活性

甘草wra/em7+s)根的果胶多糖类中提取出的中性低聚糖一多 羟糖酸组分，具有抗补体和促有丝分裂活性[6]。其中，最长和最短的低聚糖 一多羟糖酸组分，具有相对强的抗补体活性，而其余所有低聚糖一多羟糖酸

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组分，仅表现弱的抗补体活性，但有显著的促有丝分裂活性。

1.1.4抗抑郁活性

中药巴戟天系茜草科巴戟属植物巴戟天■丑ow)的根经 炮制而成的传统中药，具有补肾壮阳、强筋祛风之功效。崔承彬等经各种抑 郁模型筛选发现，巴戟天提取物有明显的抗抑郁活性。经进一步萃取、透析、 凝胶柱色谱及高效液相色谱等分离手段得到4个具有显著抗抑郁活性的寡糖 单体[7]，结构式见图1-1。

图1-1巴戟天寡糖结构

Figure 1-1 Structure of Morinda officinalis How oligosaccharide 1.1.5免疫增强活性

寡糖能在多个途径、多个层面对免疫系统进行调节。甲壳素是N-乙酰基 -D-葡萄糖胺以0-1, 4苷键结合而成的多糖。它是蟹、虾、昆虫等的外骨骼及 蘑菇等菌类的细胞壁的构成成分，是广泛存在于自然界的天然高分子物质。 它的脱N-乙酰基化合物称为壳聚糖。甲壳质、壳聚糖部分酸解可分别得到几 丁寡糖(chitin oligosaccharides)和壳寡糖（chitosan oligosaccharide)。

几丁寡糖是指N-乙酰葡萄糖胺以P -1, 4苷键连接而成的3〜10个单元的 低聚糖（GluNAc3-GluNAc10)。壳寡糖是D-葡萄糖胺通过1, 4键合而形成的 3〜10个单元的低聚糖。壳寡糖具有调节激素分泌、调节人体内pH值、增强

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人体免疫力的功能，且容易被人体吸收(吸收率接近100% ,是壳聚糖的数十 倍)，在改善食品结构，提高食品保水性能方面有重要作用。此外，壳寡糖具 有能被溶菌酶分解的性质，可以使用壳寡糖的衍生物作为医疗诊断的指标[8]。

在医药方面，近年铃木等发现N-乙酰壳寡六糖具有很高的抗感染、抗癌 活性；Minami等人也验证了壳寡糖对伤口的愈合有显著的作用，有望成为实 用的医用品；另外发现几丁寡糖、壳寡糖还在植物生长、分化及生物体抗御 方面具有信号传导活性[9]。

壳寡糖作为早期肿瘤的治疗药物，具有刺激淋巴细胞攻击癌细胞和抑制 癌细胞转移的功能。其作用机理为乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖残基与巨噬 细胞表面受体结合后，激活巨噬细胞释放IL-1，同时引起T细胞表面IL-2受 体表达，而这又加速了 T细胞成熟而释放IL-2, IL-2与受体结合后，进一步 加速T细胞分化为细胞毒性T细胞，从而产生抗肿瘤作用[10]。

中科院大连化物所1805组用壳寡糖腹腔注射昆明种小鼠，检测了抗体生 成细胞，血清溶血素水平，ConA诱导的T淋巴细胞转化率，迟发型超敏反应， 试验结果证明，壳寡糖能显著增强小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能[11]。 此外，Rina Saksena等从水牛的乳汁中提取出一种五糖寡糖，也具有重要的 免疫活性。其结构为：GlcNAc 运（1—3) Gal 运（1 —4) GlcNAc 运（1—3) Gal 3(1 —4) Glc。这种寡糖经过处理后注入BALB / c小鼠体中，可同时诱发小 鼠产生迟发型超敏反应应答和产生基于巨噬细胞数量的非特异性免疫应答 [12]。实验结果提示该五糖寡糖是一种免疫刺激剂。

1.1.6抗病毒活性

许多天然寡糖提取物具有重要的药理活性。研究者根据它们的作用机理 和构效关系进行合理的结构改造修饰，可以得到一些有更好药理活性、更低 毒副作用、更适于作为药物使用的化合物。Kaname Katsuraya等合成的磺酸 化的寡糖有很好的抗HIV活性[13]。这些化合物是由4〜6个单糖组成的罗布

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寡糖衍生物，其化学式如图1-2。

图1-2罗布寡糖的衍生物 Figure 1-2 Ramification of Loboligosaccharide K. Katsuraya等详细研究了这些衍生物的合成及其构效关系，发现单糖数 越多，其抗HIV活性越高；寡糖的磺酸化程度越高，其活性也越高；R基团 的碳原子数适当提高，也使得化合物的抗HIV活性提高。最终发现磺酸化程 度最大的十二烷基罗布六糖寡糖具有最高的抗HIV活性和最低的细胞毒性。

1.1.7抗菌活性

早在1979年，Allan等就发现壳寡糖对多种微生物如真菌，藻类和一些 细菌显示出广谱抗菌活性。其抗菌活性在真菌和藻类比细菌表现的更为直接。 研究表明，壳寡糖对大多数的植物病原真菌孢子萌发形成菌丝体和细菌的生 长均有一定程度的直接抑制作用，但不同性质的壳寡糖或对不同的病原菌， 其抑制强度有很大的差异[14]。

壳寡糖的抗菌作用主要通过两种途径实现：一种是壳寡糖通过吸附在细 胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，从而起到抑 菌、杀菌的作用；另一种机理是壳寡糖通过渗透进入细胞体内，吸附细胞体 内带有阴离子的细胞质，并发生凝絮作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而 杀灭菌种[15]。不仅壳寡糖具有抑菌活性，许多由微生物胞外分泌的多糖降解 得到的寡糖类物质也具有较强的抗菌性，比如黄原胶寡糖(oligoxanthan)对番 茄早疫病菌等植物致病真菌具有较强的抑制。

Ziracin也是一种神奇的寡糖类药物，它是由2个原酸酯、1个硝基糖、1

5

个亚甲基二氧基团和2个芳香酯残基构成的整个分子包含35个手性原子[16] 的化合物。Ziracin和扁枝衣霉素、居拉霉素、阿维霉素等都是属于晚霉素抗 菌素家族，而且是开发用于人类的晚霉素抗菌素家族的惟一成员。作为抗菌 素类药物，Ziracin还有其独特之处，它不但对抵抗革兰氏阳性菌有很高的活 性，而且对耐甲氧西林的葡萄球菌素、耐万古霉素的肠球菌素也有很高的活 性。虽然在Ziracin第二及第三阶段的研究中出现安全问题，使得Ziracin没 有成为药物，但这也为以后开发抗菌素提供了新思路。

1.1.8抗炎活性

炎症反应的起始过程是由选凝素（selectin), —种能与碳水化合物结合的 受体所调控的[17]。选凝素是一类处于细胞表面的生物受体，它能特异性的识 别寡糖分子，并与之结合从而实现细胞间的选择性结合。目前发现的与免疫 反应有关的选凝素共有3种类型：E2, P2, L2选凝素[18]。动物模型显示所 有3类选凝素均在急、慢性炎症中发挥作用，但作用条件却有所不同。研究 发现一类同时能被3类选凝素识别的四糖结构sLex与sLea，这两种寡糖的区 别仅在于它们分子中半乳糖基和岩藻糖基与N-乙酰氨基葡萄糖的连接方式 不同，但其空间取向相似。虽然sLex与选凝素在体外结合较弱，但其的确具 有显著的抗炎效果，现已进入临床[19]。

1.1.9抗凝血活性

聚阴离子寡糖有着良好的抗凝活性。研究发现了大量副作用较小的抗凝 剂，其中以低分子量肝素(LMWH)最为突出，此外还有硫酸软骨素B、合成 二麦芽糖酰胺酸及与抗凝血酶III (ATIII)结合的肝素五糖等。肝素与ATIII结 合的部分为一独特的五糖结构，约占自然肝素的1 /3以下，称为核心五糖[20]。 当低分子量肝素(包括核心五糖)与ATIII结合，后者被激活，直接与凝血酶 Xa因子作用产生抗凝作用。当在普通肝素存在下，除凝血酶Xa因子以外，

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Ila因子还可与肝素和ATIII形成的复合物结合，同时产生抗凝活性和出血副 作用[21]。所以LMWH与许多寡糖有较小的副作用。寡糖保持了较好的抗凝 活性，副作用又小，而且它有了合成的可能性，可以得到单一化合物，符合 当今药物开发的大趋势。

1.1.10其他活性

肝素是一种高硫酸化、复杂、多分散的线形糖胺聚糖（GAG)，其摩尔 分子质量范围为5X103〜4X104。经化学解聚或酶催化解聚肝素可得到低分 子量肝素(LMWH)及肝素寡糖，肝素寡糖仍然是不均匀聚合物的混合物，其 分子量分布为(2〜8)X103。但与肝素相比，肝素寡糖药理学分布曲线得到改 善，表现出较好的抗血栓活性和其它生物药效，并且减少了副作用，因此近 年来肝素寡糖得到广泛研究[22]。LMWH已被证明是预防DVT安全而有效的 药物，目前正在进行新的适应性研究，其中之一是对于变态反应性哮喘的病 人吸入LMWH可以改善其肺功能，超低分子肝素被认为能够抑制冠状和外 周动脉硬化的形成[23, 24]。

寡糖作为一种天然的高分子物质，广泛存在于自然界之中，来源十分丰 富。近年来，随着分子生物学、药学、现代分析化学等多学科领域的飞速发 展，寡糖类物质所具有的众多其他物质无可比拟的生物活性逐渐吸引了人们 的目光。在如今科技高速发展的21世纪，该类物质的研究、开发与利用必将 具有更加广阔的前景。

1.2黄原胶简介

黄原胶（xanthan gum)是二十世纪五十年代美国农业部北方研究室 (Northern Regional Research Laboratories，NRRL)，从野油菜黄单孢菌

決owo肌s1 ca—e你^ ) NRRL B-1459中发现的分泌的中性水溶性多糖，

又称为汉生胶。

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黄原胶是一种由重复单位组成的高分子多糖（图1-3 )。黄原胶中存在 的糖为D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸。葡萄糖以P-1，4-键连接，形 成葡聚糖纤维素骨架。间隔的葡萄糖基有一短的支链，这条支链是由1个葡 萄糖醛酸插到2个甘露糖单位中所组成，所以侧链组成为P-D-甘露糖-(1，4) -P-D-葡萄糖醛酸-(1，2) - a-D-甘露糖。末端甘露糖部分可以在4位和6位 连接丙酮酰残基。内部的甘露糖单位C6位乙酰化。侧链上连接的乙酰基和 丙酮酰残基的量的变化取决于黄原胶是由哪一类野油菜黄单胞菌中分离得到 的，丙酮酸的含量的变化同样与发酵条件有关。平均约半数的末端甘露糖携 带有丙酮酰基，丙酮酰基和乙酰基的数量和位置使原本非常有规律的结构呈 现出不规律性。

n

8

1.2.1黄原胶的性状

黄原胶为乳白、淡黄至浅褐色颗粒或粉末状体，微臭。易溶于水，水溶 液呈中性，为半透明体。低浓度水溶液的黏度也很高，如0.5%溶液的黏度为

0.4Pa.s。在水溶液中，黄原胶分子的侧链紧紧缠绕着纤维素主链，所以黄原 胶溶液有很强的耐酸、耐碱、抗生物酶降解和耐热的性能，因此其黏度不受 pH值和温度变化的影响。其黏度也不受蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等影响。 在水溶液中，黄原胶分子的侧链带有负电荷，具有很强的结合阳离子的能力， 使得阳离子不能作用于主链，因此，黄原胶溶液的黏度不受盐的影响。温度 不变时，受机械力的作用，可发生溶胶与凝胶的可逆变化。搅拌可使溶液的 黏度下降。静置则又升高（牛顿塑性）。黄原胶能溶于多种酸溶液，如5% 的硫酸、10%的盐酸和25%的磷酸，且这些黄原胶酸溶液在常温下相当稳定， 数月之久仍不变。黄原胶也能溶于氢氧化钠溶液，并具有增稠特性，所形成 的粘溶液在室温下十分稳定。

1.2.2黄原胶的性能

黄原胶水溶液的黏度几乎不受温度、酸碱度和盐类的影响[27]，因此它是 食品的良好增稠剂。黄原胶溶胶分子能形成超结合带状的螺旋共聚体，构成 脆弱的类似胶的网状结构，所以能够支持固体颗粒、液滴和气泡的形态，显 示出很强的乳化稳定作用和高悬浮能力。

黄原胶与海藻酸钠、淀粉等增稠剂能很好地互溶，故可复配使用。与卡 拉胶、槐豆胶、瓜胶有协同效应，与卡拉胶复配使用可提高弹性，与槐豆胶 或瓜胶复配使用可提高黏性[28, 29]。

1.2.3黄原胶的应用

黄原胶由于其独特的剪切稀释性质，良好的增稠性，理想的乳化稳定性， 对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性，以及对人体的完全无毒害等许多优

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良的特性，因而在食品、石油、医药、日用化工等十几个领域有着极其广泛 的应用，其商品化程度之高，应用范围之广，令其他任何一种微生物多糖都 望尘莫及。现略举一二。

1)食品方面

许多食品中都添加黄原胶作为稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂和加工 辅助剂。黄原胶可控制产品的流变性、结构、风味及外观形态，其假塑性又 可保证良好的口感，因此被广泛应用于色拉调料、面包、奶制品、冷冻食品、 饮料、调味品、酿造、糖果、糕点、汤料和罐头食品中。近年来，较发达国 家的人们往往担心食品中的热值过高而使自己发胖，黄原胶由于其不可被人 体直接降解而打消了人们的这一顾虑。此外，据1985年日本的报道，对十一 种食品添加剂进行对比测试，黄原胶是其中最为有效的抗癌试剂。

2)日用化工方面

黄原胶分子中含有大量的亲水基团，是一种良好的表面活性物质， 并具有抗氧化、防止皮肤衰老等功效，因此，几乎绝大多数高档化妆品 中都将黄原胶作为其主要功能成分。此外，黄原胶还可作为牙膏的成分 实质增稠定型，降低牙齿表面磨损。

3)医学方面

黄原胶可以作为控释剂用于制药行业。凝胶化黄原胶微球将活性成分包 裹在内，这种微球在干燥状态下被吞咽，在胃中膨胀，进而逐渐释放出活性 成分活性分子同样可以与多糖共价结合，然后在体内水解酶的作用下逐渐释 放；由于其自身的强亲水性和保水性，还有许多具体医疗操作方面的应用， 如可形成致密水膜，从而避免皮肤感染；减轻病人放射治疗后的口渴等。此 外，李信、许雷曾撰文指出，黄原胶本身对小鼠的体液免疫功能具有明显的 增强作用网。

4)工农业方面的应用

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黄原胶最重要的工业应用在于石油钻探。在这个应用中，由于黄原胶的 假塑性行为、温度稳定性以及耐盐性，使得其非常有用。黄原胶在石油生产 中的应用已由Pettit和Kan进行了综述。在石油钻探中，钻头上要求有低黏 度，而在环形套筒上则要求有高黏度，因此含有黄原胶的钻探液体允许钻头 快速穿透，而在环形套筒则为钻粉悬浮液[27]。

在织物印染上，通过阻止染料的迁移，黄原胶赋予了织物印花特殊的流 变学性质，而这种流变学性质对制备图案明晰而规则的产品是必需的。黄原 胶能与大多数印染材料相容，并且很容易经过洗涤去除。黄原胶还可用于陶 瓷釉料，其能阻止不同组分的凝聚作用。

人们对黄原胶的发现以及随后对其结构功能进行的大量研究，触发了人 类对微生物多糖优良的性质的强烈好奇，引发了发酵史上不小的轰动。迄今 半个世纪已过，人们依然没有降低对黄原胶的研究热情（据估计，全世界对 黄原胶的需求量每年以7%〜8%的速度增长，仅从世界石油组织分析结果显 示，近期世界石油行业钻井和三次采油方面需要黄原胶将达90万吨/年〜100 万吨/年），随着研究的进一步深入以及生产工艺的进一步改进，黄原胶应用 潜力仍然很大。

1.3黄原胶的生物合成

黄原胶的合成，从五元糖重复单位的装配开始，然后这些重复单位聚合 生成大分子。这些黄原胶寡糖重复单位是通过来自于高能糖核苷酸的单糖的 按序添加形成的。高能糖核苷酸包括乙酰辅酶A和磷酸烯醇式丙酮酸。来自 于内膜的多萜醇磷酸盐作为受体[31]。五元糖装配的第一步是UDP-葡萄糖上 1-磷酸糖基转移到多萜醇磷酸盐上，然后再逐个的按序将其他糖残基转移上 去，D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸分别来自GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸，从 而得到完整的与脂相连接的五元糖重复单位。乙酰基和丙酮酰基是在这个与 脂连接的五糖阶段添加的，其分别由乙酰辅酶A和磷酸烯醇式丙酮酸提供。

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与内部甘露糖残基相连的O-乙酰基以及连接在末端甘露糖上丙酮酸的数目 会发生很大的变化，这取决于菌株及发酵条件。黄原胶链的增长发生在还原 末端（如图1-4)。生物合成的最后一步，是将黄原胶从细胞膜上分泌出去。 穿过周质和外膜分泌到胞外环境的过程还没有得到完全的阐述。这个运转的 过程需要能量，并且可能是通过一个特殊的运转系统，这个系统保证将高聚 物从脂类载体上释放出来并且进行跨膜运转[32]。

图1-4黄原胶的生物合成 Figure 1-4 Biosynthesize of xanthan gum

Ac-乙酰基；Glc-葡萄糖；Man-甘露糖；P-磷酸盐; PEP-磷酸烯酮式丙酮酸；Pyr-丙酮酸

12

gumB〉gumC〉gumD〉gumE〉gumF〉gumG〉gumH〉gumI〉gumJ〉gumK〉gumL〉gumM〉

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图1-5野油菜黄单胞菌生物合成中黄原胶操纵子的遗传图谱

Figure 1-5 Genetic map of xanthan gum operon in Xantho'mo'nas cam^estri

biosynthesize

参与黄原胶生物合成的许多基因已被鉴定、分离和表征（如图1-5)。在 野油菜黄单胞菌致病变种（Xanthomonascampestrispv.campestris)中，黄原 胶的生物合成由一个12个基因组成的基因簇(丛gumB到gumM)指导[33, 34]。 单糖的转移和脂质中间体乙酰化以形成完整的乙酰化重复单位，需要7个基 因产物的参与。这个基因簇并不与合成糖核苷酸前体所需要的基因相连。这 个基因簇的12个基因以单一操纵子的形式从第一个基因上游的启动子开始 表达。黄原胶的合成看起来并没有受到特别的控制，但实际上，至少这个基 因簇中的5个基因产物对黄原胶合成起着活化作用。Pollock等（1997)克隆 了鞘氨醇单胞菌（分hi+ngomonas)中编码黄原胶的装配、乙酰化、丙酮酰化、 聚合和分泌的12个基因，这些基因对于黄原胶的合成已经足够。来源于重组 微生物的黄原胶与天然的黄原胶在结构和功能上没有什么分别[35]。

1.4黄原胶的降解

黄原胶是一种高聚合度的微生物多糖类物质，根据其分子量不同应用在 不同的领域。当其以高聚合度状态存在，往往利用其高粘度及较高的稳定性 等物理性质应用在食品、化工和医药等领域。然而黄原胶超乎寻常的稳定性 本身也是一把双刃剑，在增加其普及度的同时也产生了一些问题。比如在采 油业中，由于使用黄原胶而增加了溶液的粘度，从而大大增加了后续工艺如 油料运输及产品纯化的成本。唯有将其降解才能使对黄原胶的应用做到“进 可攻，退可守”。

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随着分子生物学和医学的发展，寡糖的生物活性引起了研究者的瞩目， 因而造就了目前寡糖工程在国际上竞相研究、炙手可热的局面。由植物致病 菌分泌的黄原胶所降解的寡糖是否也拥有某种生物活性的疑问也激起了人们 强烈的兴趣。随之而来的问题就是降解，如何降解，降解到何种程度。

尽管黄原胶的主链与纤维素相同，但由于规则的螺旋结构的保护，以及 侧链所产生的位阻，使得一般的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶等 都很难将其降解。多糖的降解，通常可用酸（如盐酸、次氯酸）或强氧化剂 (如过硼酸钠、过硫酸铵），尽管这在实验室效果不错，但在实际应用中效果 不理想。

1980年，M.Rinaudo等人第一次报道用一种纤维素酶对处于不规则构象 的黄原胶主链进行随机降解，然而，对于一般规则的螺旋构象的黄原胶而言， 该酶几乎没有降解作用。随后，1981年，Cripps等人的研究小组发现了一种 能以黄原胶为唯一碳源生长的土壤棒状杆菌，命名为NCIB11535。用薄层层 析分析其降解产品，降解产物有九种，而对于脱乙酰的黄原胶而言，降解产 物只有四种，分别是甘露糖，甘露糖与丙酮酸的缩酮产物，以及两种寡糖产 品（专利 WO0030393)。

Ruijssenaars等（1999)在一株类芽孢杆菌（Paew+toc///狀）中发现了几

种能降解黄原胶的酶。这株菌的酶能够降解约整个黄原胶分子的1/3,而不会 攻击其分子骨架[36]。最近，日本京都大学的Murata等人详细报道了用一株芽 孢杆菌降解黄原胶的途径（如图1-6)。降解黄原胶所需要的酶有黄原胶水解 酶、葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸水解酶以及甘露糖苷酶。由于胞外 黄原胶水解酶的作用，降解首先开始于黄原胶侧链上丙酮酰基化的甘露糖与 葡萄糖醛酸残基之间糖苷建的断裂；接着黄原胶受到胞外P-D-葡聚糖酶的攻 击，产生一个四元糖，这个四元糖就是没有末端甘露糖残基的黄原胶重复单 位；然后，这个四元糖被带入细菌细胞内，被P-D-葡萄糖苷酶转化，产生不

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饱和的葡萄糖醛酸-乙酰甘露糖-葡萄糖三糖；随后，葡萄糖醛酸水解酶水解 产生一个不饱和的葡萄糖醛酸和甘露糖-葡萄糖双糖；降解的最后一步是a- 甘露糖苷酶将双糖水解为甘露糖和葡萄糖[37, 38]。

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图1-6芽孢杆菌降解黄原胶途径 Figure 1-6 Xanthan depolymerization pathway in Bacill^us sp. strain

有关微生物黄原胶侧链酶的基因克隆和结构研究代表了这一领域最新、 最重要的进展。通过将黄原胶侧链酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细 胞，可以使黄原胶侧链酶的发酵产率得到大幅度提高。此外，对黄原胶侧链

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酶结构的详细了解为基因的克隆提供了必要信息的同时，使合适的酶在工业 化生产中得到应用成为可能。毫无疑问，微生物黄原胶侧链酶的基因克隆对 酶的生产和黄原胶寡糖结构鉴定方面有着深远的影响。

1.5降解黄原胶菌株的简介

鞘氨醇单胞菌（分如WgOWOWOS1年.）是一类有着重要商业应用前景的细菌。 从形态上看，主要为球菌和杆菌，并且均为需氧的革兰氏阴性菌。鞘氨醇单 胞菌在自然界分布广泛，从土壤、河水、深层堆积物、血液、伤口等处均可 分离得到。在与植物相关的环境中（如根的周围）发现的最多。近来报道， 这类细菌在工业、农业、医药等与人类密切相关的领域里应用价值很高。比 如它们可以降解不熔的污染物，可以作为植物致病真菌的抑制剂还可以分泌 具有高附加值的胞外多糖如瓜胶等[39]。

基于16S rRNA同源序列分析，该类细菌在蛋白菌的a-4亚基中形成系 统连接紧密的集团[40]。尽管有些鞘氨醇单胞菌不运动、不发酵，但是几乎所 有该属的细菌都包含一个类似于“标签”一样的结构，即，含有18〜21个碳 的直链饱和二氢鞘氨脂、单不饱和二氢鞘氨脂以及含有环丙烷的二氢鞘氨脂。 除此之外，它们还拥有一个可以利用苯醌的长链及十个类异戊二烯单元的侧 链。DNA检测结果显示，鞘氨醇单胞菌属细菌G+C含量大约为61%〜67%[41]。 鞘氨醇单胞菌的外膜结构比较特殊，包括鞘糖脂，缺少脂、氨连接的三羟基 脂肪酸并且缺乏脂多糖成分或者具有革兰氏阴性菌特征的成分。

一般来说，微生物是靠分泌降解酶降解生物高分子进而摄入降解产物而 生存的。而鞘氨醇单胞菌的作用机制似乎不太一样，它是通过一种类似于“吞 噬作用”来利用胞外多糖的。鞘氨醇单胞菌的细胞表面被数量巨大且结构复 杂的辨状物所覆盖。Murata等发现[42]在褐藻多糖的存在下细胞表面形成了类 似于嘴状的凹陷，而褐藻多糖则集中在凹陷周围。显示了细胞膜陷入细胞质

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这样特殊的结构。由于多糖酶仅仅存在于细胞质中，甚至不会分泌到周质中， 所以其机理可能是靠细胞的内吞作用进入细胞的（如图1-7)。对于革兰氏阴 性菌，膜的内部是立体选择性转运系统，外部是非立体特异性多孔结构适合 转运低分子的底物。而高分子物质如蛋白、多糖是通过其他机制实现的。

图1-7鞘氨醇单胞菌的细胞结构 Figure 1-7 Cell structure of Sphingomonas sp.

I图：在褐藻多糖存在下，鞘氨醇单胞菌表面形成的嘴状结构（发酵时间：A， 0h； B，2h； C，7h； D，14h； E，20h； F，24h)

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II图：褐藻多糖在细胞表面的定位（A，褐藻多糖缺失条件下细胞的生长；B,

褐藻多糖存在的条件下细胞的生长）

III图：褐藻多糖存在条件下生长细胞的一部分（箭头处为嘴状凹陷）

将土样悬浮于灭菌后的生理盐水中，并进行梯度系列稀释后，按常规方 法涂黄原胶平板，于30°C培养箱中培养24小时。分别挑出单个菌落的一部 分接种于黄原胶平板，于30°C培养箱培养24小时，作为保留菌种；另一部 分接种于选择性液体培养基，并于30C振荡培养(200 r/min)，观察培养基的 粘度变化。经对培养过程中培养液下降程度和速度的比较，选出一株对黄原 胶降解能力最强的菌落作为研究用菌，命名为XT-11[1]。

2.2分泌黄原胶酶菌株的常规鉴定

细菌的常规鉴定法，在着重于细菌的表观特征描述的基础上，结合化学 分类、数值分类等各个方面进行鉴定。用于进行鉴定的菌株首先必须为纯菌。 通常所说的纯菌，一般是菌落形态一致、菌体细胞形态一致的菌株。其次要 求菌种必须生长代谢活跃，处于休眠或衰退的菌种则不适于此种鉴定。虽然 细菌的常规鉴定方法比较传统，耗费的时间较长，同时检测项目较多，比较 复杂，但由于该方法能从多个方面对细菌进行分析，故一直被用来进行细菌 鉴定。

2.2.1形态特征

试验方法：

采用革兰氏染色，待鉴定菌株于黄原胶液体培养基中30°C培养12〜36小 时，光学显微镜下观察个体形态并测定菌体大小。同时用上述培养物，采用 电子显微镜观察菌体形态、鞭毛着生情况和细胞表面结构；于牛肉膏琼脂、

23

营养琼脂、LB琼脂、蛋白胨酵母膏琼脂等4种固体培养基上，30°C培养48 小时后观察菌落的颜色和形态并测定菌落大小[2,3]。

结果与讨论：

对分离到一株能够分泌降解黄原胶酶的菌株XT-11，在光学显微镜下观 察发现(图2-1)，该菌株在幼龄时期为杆菌，大小约为0.4〜0.6pmx1.0〜2.0pm，

呈直杆形或稍弯曲，但在1周以上的培养物中，只存在0.5pmx0.5pm左右的 类球状细胞。负染电镜照片显示其侧生鞭毛（图2-2)。革兰氏染色阴性，抗 酸性染色阴性。

XT-11菌株于固体平板培养基上30 C培养2〜4天，菌落呈圆形，凸起， 较光滑，乳白色，湿润，不透明，边缘完整。

图2-1 XT-11杆状与球状菌体形态图2-2 XT-11的负染电镜扫描照片

Figure 2-1 Rod and round cell of strain XT-11

Figure 2-2 Electron micrograph of negative-stained XT-11 cell

2.2.2运动性试验

试验方法：

运动性检查采用两种方法进行。一种是在检查葡萄糖氧化发酵试验时， 通过半固体穿刺同时进行，另一种通过水浸片法检查[4]。水浸片法具体操作 如下：在LB液体培养基中将XT-11菌株于30C振荡(150 r/min)培养24小时

24

后，取1滴菌悬液置于载玻片上,加盖盖玻片后直接在高倍镜下观察。观察到 快速移动的菌体则表明待测菌株具有运动能力。

结果与讨论：

XT-11菌株属于兼性厌氧菌，按Cappuccino的方法[4]，在整个琼脂试管

中基本呈均匀生长；半固体穿刺培养和悬滴镜检结果表明该菌体无运动性。

2.2.3生长条件试验

试验方法：

用721型分光光度计在660 nm处测量最适盐浓度、最适温度和最适pH 等的生长情况。

结果与讨论：

XT-11菌株仅能在40 mg/L以下浓度的NaCl上生长；其生长温度范围为 12 °C〜35 °C，最适生长温度为30 °C。其生长的pH范围为4-8，最适pH为 7.5。

2.2.4芽孢试验

试验方法：

采用水浴80 C保温10 min或用与培养液等量的95%乙醇于20 C保温 45 min的处理方法检验芽孢是否存在。

结果与讨论：

经水浴80 C保温10 min或乙醇处理后，XT-11菌株不能生长，说明无芽 孢生成。

2.2.5碳源的利用

试验方法：

硫酸铵2 mg/L，磷酸二氢钠5 mg/L，磷酸氢二钾0.5 mg/L，七水合硫酸镁

0.2 mg/L，氯化钙0.1 mg/L。分别添加葡萄糖、鹿糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳

25

糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊 糖、纤维二糖、D-岩藻糖，并使终浓度为20 mg/L，观察测定菌株是否生长。 结果与讨论：

XT-11菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-木糖、 D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纤维二糖、 D-岩藻糖，其既不产酸也不产气。

2.2.6生理生化特征

试验方法：

在营养琼脂上，于30 °C活化培养24小时后，按文献所述方法[2,3]，对该 培养物分别进行葡萄糖氧化发酵、柠檬酸盐利用、脲酶、卵磷脂水解、还原 硝酸盐、产吲哚、甲基红（M.R)、产H2S、明胶液化、七叶苷水解、厌氧生 长及淀粉水解等生理生化试验。

结果与讨论：

1)XT-11菌株的氧化酶反应为阴性，而过氧化氢酶反应为阳性；不呈现 卵磷脂酶和脲酶活性。

2)XT-11菌不能水解淀粉、纤维素、七叶苷、酪素、明胶和油脂，但能 够分解果胶；甲基红试验阳性，石蕊牛奶反应为暗红色产酸；能够由色 氨酸生成吲哚并且能够产生硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应。对半乳糖、 乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化发酵实验检测发现，

3)XT-11菌对上述各种糖均属发酵型代谢。

4)XT-11菌不能利用柠檬酸盐，在以葡萄糖为唯一碳源和氮源的培养基 上也不能生长。

2.3分泌黄原胶酶菌株的BIOLOG-GP鉴定

早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌

26

的新方法。这些技术的应用，为微生物检验工作提供了一个简便、科学的鉴 定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得 到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、 Enterotube和BIOLOG-GP等系统。微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了 快速发展。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内微生物分 析实验室中得到了广泛应用。

BIOLOG-GP细菌鉴定系统通过在一块鉴定板上使用95种碳源进行实验 (如图2-3)。微生物利用碳源进行呼吸时，会将四唑类氧化还原染色剂，从 无色还原成紫色，从而在微生物的鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式 或“指纹”，通过纤维光学读取设备一读数仪来读取颜色变化，由于对光密 度的吸收值的差异，计算机通过概率最大模拟法，并将该反应模式或“指纹” 与数据库相比较，将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行比对，对 分析的微生物进行最大限度的匹配，可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析 的微生物的属名或种名[5]。利用天津市出入境检验检疫局BIOLOG 4.2细菌自 动鉴定分析系统，对黄原胶降解菌株XT-11进行了检测。

27

BiOLQG Gram Negative Identification Test Panel

GN2 MicroPlate™

A2

a-CyclodextrinA3

DextrinA4

GlycogenAS

Twe«n40AS

Twten <0N^c»ty(-0-

G«lactosamin9AS

N-Acetyl-D-

QlucosaminsA9

AdonitolA10

L-ArabinoseAll

D-ArabttolA12

D-Callobiose

i-ErythritolD-FructoseL-FUCOMD^SafsctOMOentiobios*a>0-Glucosem-lnoiitola-0-Uctos«Lactulo**BIO

MaltoseB11

D-MannitolB12

D-Mannose

Cl

D-Melibiosep-MethyU

D>Glucosld«0-PsiCOMD-Raff]noseL-Rhamnos«DiorWtolC7

Sucro$eD-Tr»halonC9

Turano««C10

XytitolC11

Pyruvic Acid Methyl EsterC12

Succinic Acid Mono-Methy<- Ester

01

Acetic

AcidD2

Cis-Aconitic

AcidD3

Citric

Acid04

Formic

AcidD-0«lactonic Acid LactoneD*G«l«cturonlc

Acid07

D-Gluconic

AcidD8

D-Olucosam)nic

AcidD9

D-Olucuronic

AcidD10

a-

Hydroxybutyrlc

AcidDll

P.

Hydroxybutyrlc

AcidD12

Hydroxybut^ic

Add

p-Hydroxy

Phcnylacetfc

Acid(laconic

Acida-Keto Butyric Acida-Keto Olutaric Acida-Kato Valeric AcidD,L-Uctie

AcidMalonic

AcidPropionic

AcidAcidE10

O-Saccharlc

AddE11

S»bacic

AcidEl 2

Succinic

Acid

Bromosuccinic

AcidSuccinamlc

AcidOlucuronamldeL-Alaninamid*D-Alanin«L-AUinlneL^lanyl-

glycineLnAsparagin*L-AtpaiticAcidF10

t-Olutamic

AcidF11

Olycyl-L-

Aspartic

AddFI 2

Olyeyl-L-

Glutamic

Acid

01

L-Htstidine02

Hydroxyl*

Proltn*03

L*L«ucin«04

L*Orn 丨 tWn«05L<Prolin*or

L^yroflluumlc

AcidOS

D>S«r{n«09

L-S»rin«010

L-Thr»〇filn«Oil

D,L-Camitln«012

y-Amino Butyric Acid

HI

Urocanic AcidH2

InotineH3

Uridin*H4

ThymidineH6

Phmyethyl-

amin«H6

PutrecclneH7

2-Amino«thanolH8

2,3-Butan«diolH9

GlycerolH10

D,U-a-Qlyc«rol

PhosphatBH11

a*D*Glucos«> 1-PhosphateH12

D-QIUCOM-

8-Phoiphate

图2-3适用于革兰氏阴性菌的BIOLOG板碳源

Figure 2-3 Carbon source of biolog gram negative identification test panel 培养基：

523培养基：蛋白胨8g，酵母粉4g，MgS〇4.7H2〇 0.3g，蔗糖10g，K2HPO4 2g，琼脂 18 g, H2〇 1000mL。（pH 7.0〜7.1)

试验方法：

称取特定的Biolog专用配套使用的BUY培养基75g，溶解在1250mL的蒸馏 水中，搅拌溶解10min后，加热进行完全溶解，放凉后分装在三角瓶中，进行 高压蒸汽灭菌，温度121°C，时间20min。

将上述两种培养基，在大约36°C时倒平板。放置到27±1°C的培养箱中培 养48小时，以确定平板没有被污染。然后将目标菌液接种到532培养基上进 行活化培养，进行2〜3次转种培养，时间为48小时。挑取斜面上的菌，进行 平板划线，采用分区划线的形式，得到一个培养良好的单菌落，然后进行培 养[6]，时间是48小时，温度控制在27±1C。

28

用灭菌棉签挑取已经培养好的菌落，在无菌状态下接种到浊度管中。用 空白调至100%,用酵母菌液标准管调至47±1%。再用接种后的浊度管进行 测量，用无菌水不断调整浊度的大小，以达到以上标准浊度值。

将已经调整好浊度的菌液，用微量加样器很仔细地接种到Biolog鉴定板 上，放置在一个大小相宜的托盘中，并保持一定的湿度，培养48小时。开启 鉴定系统，将已经培养好的鉴定板放置到菌种鉴定仪的读数仪上，计算机读 取数据，按照可能性大小给出10个ID的名称。

结果与讨论：

对结果进行鉴定需要考虑3个参数：可能性（Probability，PRD)、相似 性(Similarity，SIM)、位距(Distance，DIS)。SIM 和 DIS 是 2 个重要的参数，

表示测试结果与数据库相应数据的匹配程度。当DIS<5.0，SIM>0.75为良好 的匹配；SIM值越接近于1，检定结果的可靠性越高。

29

鉴定结果如图2-4所示，ID地址栏里没有显示与该菌相匹配的菌种的名 称。相似性最接近的 SIM 值=0.315<0.75; DIST 值=11.89>0.5。说明 Biolog 4.2

细菌自动鉴定分析系统库中没有与XT-11菌株类似的菌种。

鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不 完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的 细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的 手工鉴定方法为“金标准”。细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深 而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新 数据库。通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如 标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

2.4分泌黄原胶酶菌株的16S rRNA基因序列测定

16S rRNA序列分析，由Carl Woese于20世纪70年代初提出的，比较研

究16S rRNA基因序列的方法，是该领域在方法上的革命性的突破。rRNA在 每个细胞中普遍存在，细胞的核糖体rRNA可将遗传信息得以表达，转译成 蛋白质，因此这些分子具有作为指示种系发生所必不可少的性质。在相当长 的进化过程中rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部 位变化非常缓慢，以致保留了古老祖先的一些序列，这就是说，从这些排列 顺序可以探测出种系发生上的亲缘关系，而且rRNA在细胞中含量大，一个 典型的细菌含有10000-20000个核糖体，易于提取，可以获得足够的使用量， 供比较研究之用。

细菌的核糖体含有三种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别含有的核 苷酸约2900、1540和120个。5S rRNA虽然易于分析，但由于核苷酸少，没

有足够的遗传信息用于分类研究。而23S rRNA含有的核苷酸几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难，16S rRNA的核苷酸数量适中，最理想的研究对

象。

30

试验仪器：

TGL-16G高速台式离心机，上海医用分析仪器厂；

恒温水浴箱，北京西城区医疗器械厂；

电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；

PCR反应仪，大连宝生物公司；

测序仪，ABI prismtm 377 DNA sequencer pharmacia Biotech；

凝胶成像仪：Image Master VDS FUJIFILM Thermal imaging system FTI-500 试验方法：

取培养在LB培养基上24小时的供试菌体少量，黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性,加入装有200^L无菌重 蒸H2O的Eppendorf管中，旋润混勻后，沸水浴3 min, 12000 r/min离心5 min， 上清液作为模板DNA直接用于PCR扩增。

用于16S rRNA的PCR反应的引物为一对通用引物[7]。

正向弓丨物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

反向弓丨物为：5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR 反应体系(50叫)为：10xPCR 缓冲液(含 Mg2+)5pL，dNTP(5 mmol/L)1 叫，正反相引物各1叫，模板DNA1.5pL，Taq酶2.5 U，重蒸水40叫、石 錯油30pL。

PCR 程序为：94 °C 5 min； 94 °C 1 min； 50 °C 1 min； 72 °C 1 min；循环

29次；72 °C 10 min。PCR产物的纯化和测序由上海英骏生物技术有限责任 公司完成。

糖类化合物与强无机酸混合加热会脱水生成糖醛或其衍生物。这种物质 能与蒽酮、苯酚等物质缩合并显出颜色，常用来鉴别糖类。对羟基苯甲酸酰 肼（PAHBAH)法主要用于还原糖的测定，即分子中必需具有游离的半缩醛 羟基或具有a-羟基酮结构[1]。

试剂及仪器：

501型超级恒温器，上海市实验仪器总厂；

354 型 Multiscan Ascent 酶标仪，芬兰，LABSYSTEM 公司；

对羟基苯甲酸酰肼(p-Hydroxybenzoic Acid Hydrazide，PAHBAH)购自 Sigma 实验方法：

PAHBAH 溶液的配制：取 0.5gPAHBAH 溶于 9.5ml 的 NaOH (5°%) PAHBAH法测定还原糖标准曲线:分别在水解管中加入0.5g/L的Glucose 标准溶液0pl、5pl、10^l、30pl、40pl，并用双蒸水补至200pl。向上述水解 管中加入150plPAHBAH溶液，再加入600plNaOH (5%)溶液，振荡混匀， 在120°C加热15min，用酶标仪在405nm下比色。

结果与讨论：

用酶标仪测定0〜0.1g/L葡萄糖绘制标准曲线如图3-1所示，得直线方程 y=4.268x+0.149, R2=0.9973。

38 

 

图3-1还原糖标准曲线

Figure 3-1 The standard curve of reductive sugar 3.2黄原胶酶活力测定方法的建立

由于黄原胶溶液的粘度很大，其分子主链被水解则粘度下降，因此原则 上可以用底物溶液粘度下降速度来表示酶活力的大小。但是，由于黄原胶溶 液的假塑性很强，准确测定粘度的大小对粘度计的要很高。此外，测定粘度 所需样品的量相对较大。

因此，采用PAHBAH方法，选择用反应液中还原糖数量的增加速度来表 示酶活力的大小。黄原胶发酵液于9000rpm离心15min,取上清液作为酶液 按图3-2方法检测其活力。根据葡萄糖标准曲线，将两组OD504差值折算成 还原糖量，再根据酶活力单位的定义，算出黄原胶酶活力。

黄原胶降解酶的活力定义为每分钟催化形成相当于1pmol葡萄糖的还原 末端所需的酶量为一个酶活力单位。

39

沸水浴10min (反应组）

100|il上清酶液 ▼

沸水浴10min

I

150 [j! Xanthan Gum 溶液（0.25%〇)

100W上清酶液

150 pl Xanthan Gum 溶液（0.25%) ▼

30DC水浴反应30min

30°C水浴反应30min (空白组)

9000rpm 下离心 5min

取 200jl +150jl PAHBAH 溶液+600jl NAOH 溶液在 120C下加热 15min

以蒸馏水为对照，分别测定两组的OD405 图3-2黄原胶酶活力的测定方法 Figure 3-2 Inspecting method of xanthan enzyme activity

3.3 XT-11的培养及发酵参数的确定

培养基：

种子培养基的组分为：牛肉浸膏：0.3%，酵母浸膏：0.1%，蛋白胨：0.5%， 葡萄糖：1.0%，水：98.1%，pH6.8〜7.0。

发酵培养基的组成为：黄原胶：0.45%,葡萄糖：0.08%,蛋白胨：0.1%, 酵母浸出粉：0.1%,水：99.27%, pH7.0左右。

黄原胶固体培养基的组分为：琼脂粉：2%,蛋白胨：0.1%，酵母浸出粉:

0.1%,黄原胶：0.3%,葡萄糖：0.2%,水：97.3%。

基础培养基组成为：黄原胶：0.45%, MgSO4: 0.05%, K2HPO4: 0.25%， NaCl: 0.1%,水：99.15%, pH7.0 左右。

40

实验方法：

将活化后的黄原胶降解菌按1%(v/v)接种量接种至装有100ml黄原胶 液体培养基的250ml三角瓶中培养，培养温度为30°C，旋转式摇床转速为 200rpm，培养过程中每间隔一定时间取样，分别测定发酵液的OD620、pH值、 上清液中的还原糖含量（P-Hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH 法）及

粘度。

结果与讨论：

图3-3发酵液参数的变化 Figure 3-3 Fermentation diagram 将黄原胶降解菌XT-11接种于黄原胶液体培养基中培养，并测定培养过 程中的细胞浓度、还原糖含量和粘度的变化，结果如图3-3所示。由于发酵 液的配比中加入了少量的葡萄糖加快了菌株的最初生长速度，当有还原糖(葡 萄糖）存在时发酵液的粘度没有下降，说明没有降解酶的出现。发酵一天后， 发酵液中的葡萄糖耗尽，该菌株开始分泌降解酶降解黄原胶（现象反映为还 原糖的生成以及发酵液表观粘度的下降），有明显的二次生长现象，可断定 该酶为底物诱导型酶。此外，发酵液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度

41

的大幅降低，说明最先起降解作用的是主链降解酶（xanthase)，伴随着还原 糖量持续升高则说明了发酵液中侧链降解酶（xanthan lyase)的存在。而发酵 液的pH值在发酵过程中基本保持不变，只是在发酵后期略有上升。

3.4发酵条件的优化

微生物产酶是个复杂的生理生化过程，不同的培养条件直接影响菌体的 代谢，从而影响酶的产量，因此，对发酵产酶条件进行优化是提高产酶量的 前提。

试剂与仪器：

AEG-120电子分析天平，日本，岛津公司；

7901型磁力搅拌器，上海华光仪器仪表厂；

4330型pH计，英国，JENWAY公司；

对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH)购自Sigma，USA;

其他试剂为国产分析纯试剂

42 

首先考察了氮源物质对发酵产酶的影响，向基础培养基中加入1%的7 种不同种类的氮源，培养72小时后，测定菌体生物量及酶活（见表3-1)。 从表3-1中可以看出，硝酸铵发酵水平较高，而且来源容易，因此选其作为 发酵培养基的氮源物质。

表3-1氮源对菌体生长及产酶的影响

Table 3-1 Effects of nitrogen sources on the bacterium growth and xanthase production

氮源生物量（OD620)酶活 / IU.L-1

酪蛋白0.39760

蛋白胨0.333104

尿素0.32422

硝酸铵0.452338

硫酸铵0.42161

硝酸钠0.33855

氯化铵0.33628

3.4.2碳源对发酵的影响：

向基础培养基中加入1%的硝酸铵及1%不同种类的碳源，培养72小时

后，测菌体生物量及酶活，表3-2表明，葡萄糖效果最好。

表3-2碳源对菌体生长及产酶的影响

Table 3-2 Effects of carbon sources on the bacterium growth and xanthase production

碳源生物量（OD620)酶活 / IU.L-1

葡萄糖0.572444

蔗糖0.33387

D-木糖0.347217

乳糖0.452188

异麦芽糖0.247112

海藻酸钠0.511319

阿拉伯胶0.3380

D-果糖0.499282

D-甘露糖0.32952

棉子糖0.422245

43

OS ao / SSBE0!g _鬆别

值

用HCl和NaOH调节发酵培养基的pH,灭菌后用同一制备的菌悬液接 种，考察了上述优化确定发酵培养基初始pH值分别为6、6.5、7、7.5和8 时发酵液的黄原胶酶活性及菌体密度，结果显示（图3-5)初始pH 7.0时发 酵液产生的黄原胶酶活性最高，菌体密度也达到最大，因此发酵过程应该在 中性条件下进行。

图3-5 pH对菌体生长及广酶的影响

Figure 3-5 The effects of pH on the growth and enzyme production

3.4.4通气量对菌体生长及发酵产酶的影响：

在250mL三角瓶中分别加入不同体积的培养基，各接1°%种子液，在 30°C，pH 7.0, 200 r/min培养72小时后，测定各发酵液的酶活及菌体密度。

结果显示（图3-6),摇瓶装液量为30mL时其发酵液的酶活以及菌体生物量 达到最高，因此可以确定最佳摇瓶装液量为30mL。

44

5/芻0«{SO寸ao)鹊幽设

3.4.5温度对发酵产黄原胶酶的影响：

分别考察了 25°C、30°C、35°C培养温度下发酵液黄原胶酶活力随时间的 变化规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL,初始pH为7.0,接种量为1%， 摇速为200 r/min。结果可知（图3-7)在发酵温度为30C时酶活最高。

3.4.6温度对菌体生长的影响：

分别考察了 25C、30C、35C培养温度下发酵液菌体密度随时间的变化 规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL,初始pH为7.0,接种量为1%, 摇速为200 r/min。结果可知（图3-8)在发酵温度为30C时可获得最大菌体

量。

3.4.7底物浓度对发酵产黄原胶酶的影响：

考察了底物浓度分别为0.5%、1%、1.5%时发酵液黄原胶酶活力随时间 的变化规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL,初始pH为7.0,接种量 为1%,摇速为200 r/min。结果可知（图3-9)在底物浓度为1%时酶活最高。

45 

3.4.8底物浓度对菌体生长的影响：

考察了底物浓度分别为0.5%、1%、1.5%时发酵液菌体生长随时间的变 化规律，其他发酵条件为：摇瓶装量为30mL，初始pH为7.0,接种量为1%， 摇速为200 r/min。结果可知（图3-10)在底物浓度为1%时菌体生长量最高。

图3-8温度对菌体生长的影响

图3-10底物浓度对产酶的影响

Figure 3-9 The effects of concentration of xanthan on the growth Figure 3-10 The effects of concentration of xanthan

on the enzyme production

46

3.4.9种龄及接种量对发酵的影响：

按不同接种量将不同种龄的液体种子接入发酵培养基中，16〜24h的种 子产酶较高，而接种量的影响不大。

3.4.10菌株XT-11产黄原胶酶的正交试验：

根据摇瓶中单因子试验的结果，设计四因素三水平正交试验确定XT-11 发酵产酶的最佳条件。根据正交试验分析(如表3-3)，XT-11菌株产酶的最佳 条件是：培养温度30°C，起始pH为7,底物浓度为1%。其中影响最大的是 生长温度，其次是底物浓度与装瓶量，pH影响最小。

表3-3正交试验结果

Table 3-3 Result of orthorhombic testing

实验组温度（°c)pH装量（mL)底物浓度酶活力（U/mL)

1256300.50%0.3145

2257501%0.4227

3258751.50%0.4578

4306751%0.5031

5307301.50%0.4557

6308500.50%0.3698

7356501.50%0.301

8357750.50%0.3145

9358301%0.2944

Ki1.221.151.091.03--

K21.331.191.091.22--

K30.911.121.281.21--

R0.420.070.190.19--

3.5黄原胶寡糖的制备

多聚糖降解制备寡糖的方法主要有三种，即化学降解法[2]、物理降解法[3] 和生物酶降解法[4]。化学法由于不易控制，降解产物为价值不大的单糖，得 不到所需的低分子量寡糖，且对环境污染严重，已逐渐被淘汰。物理降解法

47

主要是利用电磁辐射使糖苷健断裂而产生低聚糖，它需要有一套具有高辐射 强度的电离辐射设备和相应的防护设施，目前仅处于实验室研究阶段，实际 应用具有一定的局限性。酶降解法具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成 环境污染等优点。它不仅可以获得低聚寡糖，而且容易控制寡糖的聚合度， 是低聚糖制备的方向。

试剂与仪器：

对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH)购自Sigma，USA;

其他试剂为国产分析纯试剂；

4330型pH计，英国，JENWAY公司；

GL-21M高速冷冻离心机，湘仪离心机厂；

QHZ-98A全温度振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；

BIOSTAT发酵罐，德国，Heidolph公司

实验方法：

将培养3〜4天的发酵液（以培养液的粘度大幅度降低为根据)在9000rpm， 4°C条件下离心15分钟以除去菌体，留上清液备用。黄原胶溶于磷酸盐缓冲 液（60mmol/L，pH=5.9)中配成2°%Xanthan Gum溶液。将上清液作为粗酶 液与2°%Xanthan Gum溶液于30C恒温摇床中保温酶解。选取不同的时间终 止酶解反应，测溶液粘度、生物量、还原糖三项指标。在9000rpm，4C条件 下离心15分钟以除去菌体，用Sevag法除去蛋白[5]，经乙醇洗涤后浓缩冻干 可得粗寡糖。

48

结果与讨论:

为了确保降解充分，首先选取粗酶液与底物浓度5: 1的比例进行反应。 结果发现（图3-11) , 24小时底物粘度下降98%，同时还原糖含量达到最高， 而菌体密度在降解的过程中随时间的推移不断的增长。

图3-11黄原胶降解参数曲线I Figure 3-11 Diagram curve of xanthan degrading I

在对第一次酶解参数进行分析的基础上，对粗酶液与底物浓度的配比进 行了调整，降低到了 1 1进行第二次酶解分析。第二次酶解结果（如图3-12) 显示出了与第一次相类似的特性。42小时底物粘度下降99%以上，同时还原 糖含量达到高峰，菌体密度随着酶解的进行不断增长。可见，在第二次酶解 条件下，虽然酶解时间增长了近一倍，但却大大节省了酶液的用量，因此这 个条件更有利于黄原胶寡糖的制备。

49 

 

图3-12黄原胶降解参数曲线II Figure 3-12 Diagram curve of xanthan degradingH

3.6本章小结

本章对影响鞘氨醇单胞菌XT-11菌株产黄原胶酶的主要因子进行了研 究，筛选出有利产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明，酶形成的适宜温 度为30°C，培养基适宜起始pH值为7.0，培养基适宜底物浓度为1°%，摇瓶 发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。适宜种龄为16〜24h,接种量 对发酵影响不大。通过四因素三水平的正交实验，确定了温度对于菌株XT-11 发酵产酶的影响最大，装瓶量与底物浓度的影响次之，pH值影响最小。同时 也对黄原胶酶法降解的工艺条件进行了初步的探究，确定了粗酶液与底物溶 液浓度比为1: 1的条件更有利于黄原胶寡糖的制备。

在生物体生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基。自由基不仅 是生物体多种生理功能的启动因素和生化反应的介导者，同时也在免疫细胞 因子网络中起调节、信号转导作用。

细胞的正常代谢活动也会产生各种活性氧自由基，但正常情况下机体各 种抗氧化酶或抗氧化剂能维持活性氧代谢的平衡。一旦这种平衡打破，造成 体内活性氧积聚，即可引起机体病变。人类的多种疾病，包括肿瘤、心脑血管 病、糖尿病、老年痴呆症以及衰老等都与活性氧自由基有关[1]。

因此，具有清除自由基效能的某些外源性抗氧化剂如抗坏血酸、维生素 E、胡萝卜素类和多酚类等化合物受到重视[2]。近代医学研究成果表明，生物 活性多糖也具有较强的抗氧化能力。研究发现鼠尾藻多糖、褐藻多糖、黄原 胶及其衍生物、甲壳质及其衍生物[3]都具有较好的清除自由基活性或体内抗 氧化活性。黄原胶在食品、医药卫生等方面有广泛的应用。但由于其凝性强， 不易被吸收，黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性,在应用方面受到很大的限制。而黄原胶经酶降解成为寡糖后， 水溶性好，有利于人体吸收，黄原胶寡糖的研究将会成为新的热点。

4.1.1黄原胶寡糖清除DPPH自由基活性

1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH*)是一种稳定的自由基，在有机溶剂（如 乙醇、甲醇）中呈紫色，在517nm处有强吸收。加入抗氧化剂后，一部分自 由基被清除，使吸收减弱，可借此来评价该物质的抗氧化活性，并已成为鉴 定一种化合物是否有此活性的经典方法[4]。

52

实验试剂及仪器：

DPPH •，Sigma 公司；维生素 E，Sigma 公司；BHT，Sigma 公司；Trolox, Sigma公司；乙醇，市售分析纯；6505紫外/可见光分光光度计。

实验方法：

(1)标准曲线的配制

I将DPPH •溶于乙醇中，配制200pmol/LDPPH •溶液。

II 将 a-tocophero 溶于乙醇中，配制 0pmol/L，12.5pmol/L，25pmol/L， 50pmol/L，100pmol/L 的 a-tocophero 溶液。

III将DPPH •溶液与a-tocophero溶液在水解管中等体积混合，向反应体系 中通入氮气置换出其中的空气，立即旋紧盖子。

IV避光反应60min后测定反应液的OD517。

(2)黄原胶寡糖清除DPPH •作用的测定

将要测定的试样换为不同浓度的黄原胶寡糖，其余步骤同上。

(3)不同抗氧化剂对DPPH •清除的比较

以 BHT、Trolox、a-tocopherol 作为参照，根据 Alexandre C 和 Takashi Y 等人的研究，并进行设计改良，用DPPH法测定分析比较了其抗氧化活性。

具体方法是：2ml抗氧化剂溶液中加入2X10-4mmol/L的DPPH无水乙 醇溶液2ml，摇匀，于517nm处测定其吸光度，每5min测一次，直至吸光 度的变化在1°%以内。其中BHT、a-tocopherol为0.1mg/mL无水乙醇溶液； Trolox为0.1mg/ml水溶液；黄原胶寡糖为2mg/mL水溶液。

结果及讨论：

DPPH•清除效率的计算：

DPPH •清除效率=[A0-(A1-A2)]*100%/A

其中，Ac:DPPH •溶液+有机溶剂的吸光度；A1:DPPH* +抗氧化剂

溶液的吸光度；A2:有机溶剂+抗氧化剂溶液的吸光度。

53

a-tocopherol (umol/L)

图4-1 a- tocopherol清除DPPH的标准曲线 Figure 4-1 DPPH scavenging activity of a-tocopherol

糖对DPPH •的清除效率

(％)赚涯«£da

54

图4-2黄原胶寡糖清除DPPH结果 Figure 4-2 DPPH scavenging activity of oligoxanthan

(1)阳性对照a-tocopherol对DPPH •清除效率标准曲线的绘制

图4-3不同抗氧化剂抗氧化活性的比较（DPPH法）

Figure 4-3 The scavenging effect of antioxidants on DPPH •

小结：

I .黄原胶的降解产物（Oligoxanthan)有较强的抗氧化活性，且随着浓度的 增加，酶解产物清除DPPH自由基的活性增大。当浓度为2000ppm时，清除 DPPH的效率即达到了 70°%，相当于40pmol/L阳性对照a-tocopherol的清除

效率。

II.从黄原胶寡糖、BHT、Trolox和a-tocopherol在DPPH体系中的抗氧化 动态变化中(如图7)，可以看出，Trolox和a-tocopherol能快速清除自由基， 10min后，表现出较为稳定的抗氧化活性；BHT稍慢一些，但也明显快于黄 原胶寡糖，黄原胶寡糖80min后才基本趋于稳定。这也说明该寡糖是一种长 效的抗氧化剂。各物质的最终抗氧化活性顺序为：Trolox > a-tocopherol > BHT >黄原胶寡糖。

55 

羟自由基（*〇H)被认为是体内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物 理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。 羟基自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应, 并损伤生物膜的功能和结构，因此羟基自由基的清除对于生物体具有重要意 义。

实验试剂及仪器：

维生素E, Sigma公司；水杨酸，Sigma公司；H2O2及FeS〇4，国产分

析纯；乙醇，市售分析纯；6505紫外/可见光分光光度计。

实验方法：

H2O2和Fe2 +混合发生:Fenton反应，生成具有很高反应活性的• OH， 其能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具有清除作用的物质， 便会与水酸竞争，从而使有色产物生成量减少。

本实验以Smironff等[5]的方法为基础并改进。反应体系中含8.8mmol/L H2O21ml，9 mmol/L FeSO41ml，9 mmol/L 水杨酸-乙醇 1ml，不同浓度的寡 糖溶液1ml。最后加H2O2启动反应，37°C反应0.5小时，以蒸馏水为参比， 在510nm下测各浓度的吸光度。考察寡糖本身的吸光值，以9 mmol/L FeSO41ml、9 mmol/L水杨酸-乙醇1ml、不同浓度的寡糖溶液1ml与1ml蒸 馏水为寡糖的本底吸收。

结果与讨论：

羟自由基（• OH)是最活泼也最具危害性的自由基，往往也更难清除， 已发现许多抗氧化物质能清除其它活性氧但却不能清除• OH自由基。由表 4-1可知，添加黄原胶寡糖各实验组的OD510值低于对照组，表明黄原胶寡 糖具有一定的清除*OH的作用，且随着浓度的增加，其清除*OH的效果 亦增加。

56

Table 4-1 The scavenging effect of Oligo XG on • OH

黄原胶寡糖浓度(昭/ml)OD510清除率(°%)

500.079±0.0019.3

1000.076±0.00111.6

1500.075±0.00112.8

2500.068±0.00120.5

100(VE)0.042±0.00251.2

对照组0.086±0.001--

0 L

50ppm 100ppm 150ppm 250ppm 100ppm

图4-4黄原胶寡糖清除• OH的效果 Figure 4-4 The scavenging effect of Oligo XG on • OH

4.1.3黄原胶寡糖清除超氧自由基（O2-*)活性

超氧阴离子（Of)在机体代谢过程中是生物体内最早产生的一种活性 氧自由基。在氧分子接受电子还原为水的过程中首先产生的是超氧阴离子自 由基或其质子化产物。如果能在此阶段将其猝灭，阻断自由基链式反应，无疑 具有十分重要的意义。

实验试剂及仪器：

邻苯三酚，国产分析纯；

盐酸，市售分析纯；

57

壬

o o

4 2

(％)條盤鹅

壬

士 

6505紫外/可见光分光光度计，美国，JENWAY公司 实验方法：

邻苯三酚在弱碱性介质中会自身氧化分解产生O2_ •，利用O2_ •清除剂能 使邻苯三酚自氧化产物在325nm处的吸收峰受到抑制这一特点，进行光化学 方法测定。

取 4.5ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH8.2)，4.2ml 蒸馏水，混匀后 在25°C水浴中保温20min，取出后立即加入在25°C预热过的3mmol/L邻苯三 酚0.3ml(以10mmol/LHCl配制，空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚的HCl

溶液)。迅速摇匀后倒入比色杯，325nm下每隔30s测吸光度计算线形范围内 每分钟吸光度的增加。加入邻苯三酚前，先加入一定体积的寡糖溶液，蒸馏 水作对照，然后按下述方法计算：

抑制率（％) = (AA0-AA) /AA。X 100 AA0为邻苯三酚自氧化速率 AA为加入寡糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率 结果与讨论：

表4-2结果显示：在邻苯三酚自氧化化学发光体系中不同浓度的Oligo XG均能有效的清除O2-•，且随浓度升高，清除率也逐渐提高，存在剂量依赖 关系。相对而言其清除活性与维生素E (VE)接近。

表4-2 Oligo XG在邻苯三酚自氧化化学发光体系中对O2- •的清除

Table 4-2 Scavenging effects of Oligo XG on O2- • in 1,2,3-benzentriol auto-oxidation system

实验组（昭/ml)超氧阴离子自由基生成量（OD 325/3 min)清除率（°%)

00.374±0.0025—

500.265±0.002124.8

1000.215±0.001839.1

2000.170±0.002850.4

4000.131±0.001763.9

100(VE)0.211±0.001544.8

58

4.1.4黄原胶寡糖对H2O2诱导的红细胞溶血的作用

H2O2也是机体中一种重要的活性氧，在脂质过氧化连锁反应中往往起着 启动的作用。临床已发现，红细胞膜的氧化损伤是溶血的重要原因。H2O2造 成红细胞膜脂质过氧化，膜的流动性下降，通透性增加，从而造成膜内外物 质的内泻和外流，膜形成“小孔”，细胞内K+丢失而溶血。

实验方法：

取新鲜抗凝血，用〇.9°%NaCl溶液清洗、离心，至上清液无色。红细胞 (RBC)配成1°%的悬液，各试管分别加入1ml该悬液和不同浓度的寡糖溶 液，混勻。加入1500的0.5mol/L H2O2，生理盐水补充至1.5ml,寡糖浓度 分别为 0pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml, 37°C温 浴1小时，离心取上清，测540nm光吸收值。

结果与讨论：

由表4-3所示，H2O2可以氧化红细胞膜，导致血红蛋白逸出，从而使其 吸光值的增加，黄原胶寡糖各剂量组均可抑制这种作用。一定剂量的黄原胶 寡糖可以显著降低小鼠红细胞的溶血度。经T检验表明，各剂量组与对照组

59

相比均有极显著性差异(p<0.01)，随着寡糖浓度的升高，其清除作用也逐渐 加强，呈现量效关系，在较低的浓度水平(100^g/ml)，即有很强的抑制作用。 表4-3黄原胶寡糖对氏〇2诱导的小鼠红细胞溶血的影响

Table 4-3 Effect of Oligo XG on RBC Hemolysis Induced by H2O2

试验组黄原胶寡糖 浓度（昭/ml)OD405溶血度

(%)抑制率 ( %)

对照组(VE)500.1765±0.002569.7430.27

H2O2诱导组00.2531±0.0013--

H2O2 诱导组+Oligo XG500.2302±0.006190.959.11

H2O2 诱导组+Oligo XG1000.1942±0.005176.7323.34

H2O2 诱导组+Oligo XG2000.1413±0.003455.8344.31

H2O2 诱导组+Oligo XG4000.1122±0.005444.3355.82

图4-6黄原胶寡糖对H2O2诱导的红细胞溶血的作用 Figure 4-6 The effect of Oligo XG on RBC hemolysis induced by H2O2

60

4.2黄原胶寡糖对皮肤浅部真菌的抑制作用的研究

浅部真菌感染是临床常见病，局部常伴有明显的炎症反应，还可继发细 菌感染。其高发病率、高复发率日益受到医患双方的重视。中医辨证治疗本 病积累了丰富的经验，黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性,方法多样，疗效肯定，但亦存在汤药剂型不便等不足。 因此有必要探索与寻求疗效显著、作用广谱、副作用小、应用简便、价格低 廉的天然产物药制剂[6]。

寡糖作为一类天然的活性物质，在农业方面被认为是植物病害的有效抑 制剂，对多种植物病原真菌有抑制作用。然而，它对于非植物来源致病真菌 的抑制作用至今尚无报道。

本节是对黄原胶寡糖抑制皮肤浅表致病真菌的首次报道。

供试病原菌：

取常见浅表皮肤致病性真菌临床分离株，共5种（如图4-7):红色毛癣 菌 ^Trichophyton rubrum)、石骨样小抱子菌（Micmsporum gypseum)、犬小 抱子菌（Micmsporum)、抱子丝菌（)、白色念珠菌（ albicans)

以上菌株由大连医科大学附属第一医院皮肤科真菌室提供。

61

A:红色毛癣菌；B:白色念珠菌；C:石膏样小孢子菌；D:孢子丝菌 培养基：

沙氏葡萄糖琼脂培养基。（中国进出口商品检验技术研究所北京路桥技 术有限公司）由1%蛋白胨和2%葡萄糖等组成，pH值为7.0。

实验方法：

本实验采用常规的固体培养基加药法[7]。

(1)制备菌悬液：

将受试菌种连续2次转种至新鲜沙氏培养基以保证纯度和活力，无菌吸 管吸取2-3mL无菌生理盐水洗下菌苔，混匀、过滤、稀释，制备成菌悬液， 用比浊法矫正浊度为0.5麦氏单位（该浊度相当于1X105〜SXlO^fu.L-1)，试 验前接种菌量，用定量吸管吸取铺种沙氏平板进行活菌计数。

(2)培养基的制备：

称取5g寡糖，用水溶液定容至100mL，配制成5°%寡糖作为原液将其进 行对比稀释，再与沙氏培养基混匀，使培养基中寡糖浓度分别为625、1250、 2500、5000、10000、20000mg.L-1。

(3)接种与培养：

取0.1mL菌液接种于药物平皿上，置25〜28°C培养，于第7、14天观察 有无试验菌生长。

(4)判定结果：

每天记录观察结果，以无试验菌生长的最高药物稀释倍数为该药的MIC (最低抑菌浓度）。

62 

(1)黄原胶寡糖对皮肤浅表致病菌的抑制作用

培养14天后，犬小孢子菌、红色毛癣菌及石膏样小孢子菌在10000mg.L-1 稀释浓度始有生长，其最低抑菌稀释度为5000mg.L-1。孢子丝菌在5000mg.L-1 稀释浓度始有生长，其最低抑菌稀释度为2500 mg.L-1。而白色念珠菌则在 10000mg.L-1稀释浓度始有生长，其最低抑菌稀释度为5000 mg.L-1 (见表 4-4)。

挑选最低抑菌稀释度下未生长的菌块，重新接种于不含寡糖的沙氏培养 基上，25〜28°C培养观察14天。结果除白色念珠菌外其他4种皮肤浅表真菌 均未见生长说明黄原胶寡糖浓度对浅部真菌不仅具有抑制作用而且有杀灭作

用。

表4-4黄原胶寡糖抑菌试验结果 Table 4-4 Anti-dermatophytic effect of oligoxanthan

药物浓度 (mg/L)犬小孢子菌孢子丝菌红色毛癣菌石膏样小孢子菌白色念珠菌

20000-----

10000----+

5000+-+++

2500+++++

1250+++++

625+++++

阳性对照+++++

注：（+)试验菌生长；（-)试验菌未生长

(2)壳寡糖对皮肤浅表致病菌的抑制作用

培养14天后，犬小孢子菌与孢子丝菌在5000mg.L-1以上的稀释度始有生 长，其最低抑菌稀释度为2500 mg.L-1;而红色毛癣菌、石膏样小孢子菌以及 白色念珠菌则在10000m g.L-1以上有生长，最低抑菌稀释度为5000mg.L-1(见 表 4-5)。

63 

挑选最低抑菌稀释度下未生长的菌块，重新接种于不含寡糖的沙氏培养 基上，25〜28°C培养观察14天。结果除白色念珠菌外其他4种皮肤浅表真菌 均未见生长说明壳寡糖浓度对浅部真菌不仅具有抑制作用而且有杀灭作用。

表4-5壳寡糖抑菌试验结果

Table 4-5 Anti-dermatophytic effect of chitooligosaccharide

注：（+)试验菌生长；（-)试验菌未生长

药物浓度 (mg/L)犬小孢子菌孢子丝菌红色毛癣菌石膏样小孢子菌白色念珠菌

20000-----

10000-----

5000--+++

2500+++++

1250+++++

625+++++

阳性对照+++++

4.3黄原胶寡糖对ACE抑制活性的研究

肾素一血管紧张素系统是调节人体血压和血容量的主要机制之一。肾素

(血管紧张肽原酶）通过血液进入肝脏刺激血管紧张素原释放一种非活性10

肽，血管紧张素I。在血管紧张素I转换酶（ACE)的作用下，通过脱去C端

His-Leu二肽，由血管紧张素I转化为有生物活性的血管紧张素II。血管紧

张素II是已知最强的收缩血管的物质之一，具有收缩小动脉，兴奋交感神经，

刺激肾上腺皮质分泌醛固酮，从而产生强升压作用[8,9]。因此，抑制ACE的

活性，减少血管紧张素II的生物合成，就能起到降低血压的效果。目前临床

上使用的血管紧张素转换酶抑制剂类的降压药就是利用这种机理发挥作用的 [10-12]

〇

食物中有许多ACE抑制活性的化合物，它们大都来源于大豆蛋白、酪蛋 白、玉米蛋白、胶原蛋白及其他蛋白如鱼类蛋白等[13]。然而不仅自然界广泛 存在的蛋白降解肽具有ACE抑制活性，许多寡糖类物质也具有这种生物活

64

性。医学研究已经证明高血压和血液中cr含量密切相关。作为自然界唯一带 正电荷的碱性寡糖，壳寡糖能与cr结合，降低血液中cr的含量，使血管紧 张素转化酶（ACE)活性降低，血管紧张素II形成减少，体内缓激肽增加， 血管扩张，起到降血压作用。

实验试剂及仪器：

ACE和马尿酰组氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu):美国Sigma公司；甲醇为 色谱纯；其它试剂均为国产分析纯。色谱柱：pEliteTM C18 P/N 1522737 ( 4.6 mm i. d. x 250 mm)(大连依利特分析仪器有限公司）；检测器：UV230+紫外 -可见检测器（大连依利特分析仪器有限公司）；液相色谱泵：P230高压恒流 泵（大连依利特分析仪器有限公司）；工作站：EC2000 (大连依利特分析仪 器有限公司）；酸度计：4330 Conductivity & pH Meter (美国JENWAY公司)。 实验方法：

流动相的配制：300ml甲醇加0.5ml冰醋酸和1ml三氟乙酸，用蒸馏水 定容至1000ml,再用固体NaOH调节pH至3.30。

采用反相高压液相色谱（RP-HPLC)定量ACE与三肽底物Hip-His-Leu 反应生成马尿酸。样品溶于超纯水中，离心（7200xg，15min),保留上清液。 取样品 5pL 和 ACE (0.25U 溶于 2.5mL0.1mol/L、pH8.3、含 0.5mol/LNaCl 的硼酸缓冲液)15^L于37°C保温5min，加入25^L6.5mmol/L底物37°C反应 30min，加入5pl1mol/L的TFA (三氟乙酸）溶液终止反应，冷却至室温，取 10pl反应产物进样，通过HPLC洗脱图谱定量马尿酸的生成量，判断样品的 ACE抑制活性。

抑制率(％)=(对照马尿酸峰值-样品的马尿酸峰值)/对照的马尿酸峰值 x100%

65 

图4-8所示，HPLC洗脱图谱中的吸收峰1〜3分别代表了对照马尿酸峰 值、黄原胶寡糖马尿酸峰值以及壳寡糖马尿酸峰值。根据公式计算出黄原胶 寡糖对ACE的抑制率为12.4°%，而壳寡糖对ACE的抑制率为24.6°%。

4.4黄原胶寡糖诱抗生物活性的探索

66

植物体内存在潜在抗病性，受到外界损害和病原物侵染的植物可通过激 发子和诱导剂（inducer)激活植物抗病基因，使植物产生系统抗病性，以免 受到进一步的伤害，这一现象已在许多研究中得到证实。其中，寡聚糖作为 一种新型生物诱抗剂已在许多作物上得到应用，越来越受到人们广泛关注。 寡聚糖种类很多，目前常见的有葡聚寡糖、寡聚半乳糖醛酸、几丁质寡糖和 壳寡糖等可激活植物的防卫系统，提高植物自身免疫力[14]。

活性寡聚糖是一类由3〜10个单糖组成，具有一定结构和生物活性的聚合 体，国际上研究较多的是植物及微生物细胞壁多糖降解的寡糖片断。越来越 多的试验结果表明，植物细胞壁不仅起到防御的结构屏障作用，而且受到病 菌感染时能起到积极防御反应。一方面，植物细胞壁酶水解病原菌细胞壁中 的P-肽葡聚糖几丁质等，产生活性成分，诱导植物植保素等合成酶系基因表 达；另一方面，病菌入侵植物时，必须水解植物细胞壁的多糖，其降解产物 也能诱导植保素合成。因此，寡聚糖可有效地诱导植物产生防御反应，激活 植物的系统性获得免疫反应。

根据这一理论，由十字花科植物致病菌野油菜黄单孢菌分泌的黄原胶的 寡糖碎片很可能拥有植物的诱抗活性。

实验方法：

大豆子叶法（Soybean Cotyledon Bioassay) [15]:

豆科植物在受到病原体侵染时，能通过莽草酸途径、醋酸-丙二酸途径或 醋酸-甲羟戊酸途径，产生以异黄酮类为主的植保素，直接杀死入侵的病原体， 抑制病斑的扩大。在外源激发子的处理下豆科植物也能够产生抗性反应，合 成植保素。大豆子叶法就是利用激发子处理大豆子叶，然后通过测定子叶产 生的植保素的量，来表示激发子诱导植物抗性活性的方法。

大豆的培养：大豆种子用水洗净后，用8%次氯酸钠溶液灭菌20min，再 用无菌水冲洗干净，暗光震荡24h。次日将种子播种在铺有蛭石的培养盒中， 置于培养箱中（光照：黑暗=16h: 8h)交替培养10d，待大豆长出两片真叶 后即可进行活性测定。

活性测定方法：

剪下已经长出两片真叶的大豆子叶，用8%次氯酸钠溶液灭菌5min，然 后用无菌水冲洗干净，再用滤纸吸干。在无菌条件下用刀片削去子叶外表皮 厚约1mm，直径约6mm的伤口，用无菌水浸泡清洗，约30sec后取出，用

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滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿放10片子叶作为一个处理。每个 样品五个处理，每处理重复两次，对照用水。取配置好的样品溶液（含有 2mg/ml的链霉素）10pl加在伤口上。处理后的子叶在25°C黑暗的温箱中培 养24h,将每皿中的子叶转移到一个盛有10ml双蒸水的试管中，充分震荡后 测定〇Dm。

结果及讨论：

黄原胶寡糖具有一定的植物诱抗活性，当寡糖浓度为1000ppm时达最高 值0.73,与对照相比具有显著性的差异。低剂量时壳寡糖的植物诱抗活性要 略高于黄原胶寡糖（见图4-9, 4-10)。

0.9

0.8

0.7

9820

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

CK 50ppm 100ppm 200ppm 1000ppm 6000ppm

Oligoxanthan concentration

图4-9黄原胶寡糖大豆子叶法测定植物诱抗活性 Figure 4-9 Result of Oligoxanthan by Soybean Cotyledon Bioassay

68

1.0

0.9

0.8

0.7

98cJa〇

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1 0.0

CK 25ppm 50ppm 100ppm 500ppm 1000ppm

Chitooligosaccharide concentration

图4-10壳寡糖大豆子叶法测定植物诱抗活性 Figure 4-10 Result of Chitooligosaccharide by Soybean Cotyledon Bioassay

4.5本章小结

对黄原胶寡糖的生物学活性进行了探讨，发现：

(1)黄原胶寡糖具有很强的体外清除活性氧的能力，对羟自由基、超氧阴 离子自由基、DPPH自由基均有不同程度的清除作用。同时对由H2O2 诱导的小鼠红细胞溶血具有很好的抑制作用。

(2)黄原胶寡糖有一定的抑制皮肤浅部真菌生长的作用。

(3)黄原胶寡糖几乎没有ACE抑制活性。

(4)黄原胶寡糖有较强的植物诱抗活性。

凝集素是一类具有凝集细胞或沉降复合糖质作用的非免疫起源的蛋自质 或糖蛋白，广泛存在于动植物和微生物中。凝集素的发现距今己有100多年 的历史了，其最初的研究目的主要是为了阐明药用植物物质的毒性机理，以 及用于刺激产生抗体的免疫学研究。自二十世纪六十年代，凝集素研究发展 到了一个新的阶段，人们开始从分子水平更广泛、更深入的研究这类物质。 如今，凝集素作为抗肿瘤药物的研究已经发展到了一定阶段。它的作用是通 过免疫调节作用提高机体免疫力从而杀伤肿瘤细胞，对宿主细胞的毒副作用 很低，与传统的放化疗及化学合成药物相比，具有明显的优势。

微生物凝集素(microbial lectins, ML)最先发现的时间是1908年，黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性,Gugot 从大肠杆菌(Escherichia coli)中找到了能凝集血细胞的凝集素。至今，已发现 了 208种以上的ML物质[1]。分析得知，常见的ML在微生物体的部位为细 胞表面。它们可以与细胞联系不密切，如特定的表面细胞器上，包括细菌菌 毛(firnbria)或纤毛(pili)。这些物质有时被称作为粘附素(adhesins)，它们中许 多具凝血能力。

如同多数其他生物来源的凝集素一样，大多数ML的一个重要特性是对 某些/某种糖有结合性能，它具有可变换性和非共价性，其中有的结合能力的 特异/专一性很强。迄今发现与ML结合的糖及其衍生物之范围虽然有限，但 也达60种以上。分析认为，这些糖大多属于单糖、寡糖或者双糖之类，而以 甘露糖为多见，其次是半乳糖等。与同病原菌发生反应的动植物凝集素的结 合的糖种类相比，有一定差别[2]。

ML之所以如此引人注目，一是因为研究微生物本身所需。凝集素是微生 物自身进化发展之需。一些微生物，包括各类病原菌，需要与寄主发生各种 关系以发展自己。它们的凝集素可以是感染动物的毒力决定子，其中以大肠

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杆菌对甘露糖和galgal-专一的菌毛凝集素为突出例子。二是因为一些ML 有助于其产生菌选择识别寄主的表皮细胞，或者识别高等动物的白细胞。在 此，该凝集素起着细胞与细胞间相互作用中的识别分子(recognition molecules) 作用[3]。凝集素在此起识别活动的决定子(determinat)作用，如粘球菌 (Myxococcus)的细菌所显示的那样。这说明ML在介导各种正常和病理过程 中都起重要作用[4]。

试验材料：

1)血红细胞的制备

人的B型血样和小鼠由大连医科大学提供，动物血样取自大连市长兴农 贸市场。均取全血，用3.8 °% (M/M)枸橼酸钠溶液抗凝，各抗凝血经2000 r/min 离心10 min除去血浆，加10倍体积的TBS溶液充分洗涤，然后经1000 r/min 离心3 min去上清液，重复4次，最后经2500 r/min离心3min, —部分配成 2% (V/V)的TBS-Ca2+红细胞悬浮液；另一部分配成不含Ca2+的2 % (V/V) 的TBS红细胞悬浮液。

将红细胞悬浮于10ml TBS中，加入2mg胰蛋白酶，37°C下消化1.5小时。 然后用TBS洗3次，在TBS中配成2%红细胞悬浮液。

2)菌悬液的制备

将菌种接种于黄原胶固体培养基上，于30C的恒温培养箱中培养1-2天， 待新生菌体长出后，用 TBS-Ca2+溶液（TBS: 0.14 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl，pH=7.4; TBS-Ca2+: TBS 中含 0.01 mol/L CaCb，pH=7.4)洗下菌

落制成菌悬液。

黄原胶固体培养基组成：琼脂粉2%，蛋白胨0.1%，酵母浸出粉0.1%， 黄原胶0.3°%，葡萄糖0.2°%，水97.3%。

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试验方法：

活力测定在96孔U型微量血凝板中进行。先在每孔中加入25^L TBS-Ca2+ 溶液，再往第1孔中加入25^L样品，混匀后，再从第1孔中吸取25^L上述混合 液加入第2孔，以此类推作倍比稀释，最后在每孔中加入25^L2 % (V/V)的 TBS-Ca2+溶液红细胞悬浮液，振荡摇匀，在室温放置1〜2小时后，肉眼观察。 如红细胞不发生凝集则在“U”型血凝板小孔内沉于孔底形成一界线清晰的红 色小点；如发生凝集，红细胞之间则形成一似网络扩散的红斑块。以有红细 胞凝集活力的最大稀释度为该凝集素样品的凝集活力(凝集效价)，记为2n，以 TBS-Ca2+作空白对照。

结果与讨论：

XT-11菌悬液对人的B型血及家兔、家鸡、家鸽、小鼠等4种动物红细 胞的凝集效价见表5-1。鞘氨醇单胞菌XT-11菌悬液对家兔的红细胞凝集作 用最强，凝集效价为26；对家鸡的凝集作用次之，为24；它不凝集小鼠和家 鸽的红细胞，同时也不凝集人的B型红细胞以及胰蛋白酶处理的人的B型红 细胞。

表5-1鞘氨醇单胞菌的凝集活性 Table 5-1 Hemagglutinationg activity of Sphingmonas sp.

红细胞类型凝集效价红细胞类型凝集效价

人B型0家鸽0

胰蛋白酶处

0家鸡24

理后的人B型

家兔26小鼠0

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试验方法：

选取16种单糖、寡糖和糖蛋白，分别制成浓度为200 mmol/L的溶液。黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性, 往每一孔中加入25^L糖溶液，然后加入25^L囷悬液，最后往各孔中加入 25^L的2% (V/V)的兔红细胞-TBS-Ca2+悬浮液，在室温下静置2小时后，检 查凝集情况。

结果与讨论：

表5-2为16种糖对鞘氨醇单胞菌悬液凝集兔红细胞的影响。结果显示： 只有肝素可抑制菌悬液对兔血红细胞的凝集作用。至于其他糖类是否可以抑 制其对兔血红细胞的凝集作用，还有待于进一步的证明。

表5-2糖和糖蛋白对鞘氨醇单胞菌悬液血红细胞凝集活性的抑制作用 Table 5-2 Inhition of hemagglutination activity XT-11

抑制剂能否抑制抑制剂能否抑制

半乳糖-Heparin+

甘露糖-D(-)Ribose-

N-乙酰半乳糖酰胺-Mucin-

N-乙酰葡萄糖酰胺-Asialo-mucin-

岩藻糖-硫酸软骨素-

葡萄糖-& -Nitrophenyl-a-D-galactopyranose-

Metalose-D(+)Glucosamir hydrochloride-

Lactose-Thyroglobulin-

5.3热稳定性 试验方法：

将菌悬液样品分别在4°C冰箱及温度为20°C，30°C，37°C，40°C，50°C， 60 °C的恒温水浴中处理30min，测定各样品的凝集活力。

结果与讨论：

75

pH

1菌悬液血凝活性温度依赖性图5-2菌悬液血凝活性pH依赖性

uence of temperature on the agglutinative activity Figure 5-2 Influence of pH on the agglutinative activity

则定pH对菌悬液凝集活性影响时，使用下列缓冲液：pH为4~6的 LAC缓冲液；pH为7~9的^^-只0缓冲液;pH为10〜11的Gly-NaOH缓冲 血清样品的pH值调至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0，在4°C密封

中放置2小时，然后将各溶液的pH值调至7.4,测定各样品的凝集活力。 讨论：

-11菌悬液在不同pH值条件下的凝集反应实验表明，菌悬液中的凝集素 [的变化比较敏感（图5-2).由于在pH值低于5或高于10时兔红细胞发生 部分溶血现象，影响实验的结果，因此没有统计在结果中，但从图2 看出鞘氨醇单胞菌的凝集活性具有一定的pH值稳定性。在pH为6.0〜

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10.0范围内较稳定。

5.5 Ca2+对血凝活力的影响 试验方法：

取菌悬液25^L，在96孔U型板中与等量的TBS溶液经系列倍比稀释后， 黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性,每孔分别加入25^L的10，20，40 mmol/L的EDTA溶液，用2% (V/V)的兔 红细胞-TBS悬浮液检测其活性；若活性降低或消失，则加入0.05mol/L TBS-Ca2+溶液，观察其活性的变化。对照组用TBS-Ca2+溶液作倍比稀释，用 2% (V/V)的兔红细胞-TBS-Ca2+悬浮液检测其活性。

结果与讨论：

金属离子螯合剂EDTA对XT-11菌悬液的凝集活力没有抑制作用。将XT-11 菌悬液在40 mmol/L EDTA溶液中透析过夜后，在不含Ca2+的TBS缓冲液中透 析，然后测定其血凝活性。同时在分别加入10，20，30，40 mmol/L Ca2+的 TBS缓冲液中测定其血凝活性。发现它的血凝活性没有任何变化。这表明 XT-11菌悬液的血凝活性不受EDTA的影响，不依赖于Ca2+。

5.6鞘氨醇单胞菌XT-11的粗提蛋白对血凝活性的影响 试验方法：

将鞘氨醇单胞菌XT-11在KS-250型超声波细胞粉碎机（宁波科生仪器厂， 中国）上粉碎20 min，用含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液在4°C抽提过夜。 5000r/min离心20 min取上清液。加入硫酸铵到70。%浓度。5000r/min离心20min， 收集沉淀，溶于含0.15 mol/LNaCl的TBS溶液中，在此缓冲液中透析除去硫 酸铵。测定其血凝活性。

结果与讨论：

鞘氨醇单胞菌XT-11的蛋白样物质经硫酸铵盐析、TBS溶解蛋白沉淀、透

77 

析脱盐后，获得的粗提蛋白溶液，发现其仍然具有血凝活性。

5.7本章小结

鞘氨醇单胞菌XT-11悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集

可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca2+;在pH为6.0〜10.0范围内较稳

定；它的凝集活性在60°C时完全丧失。以上结果表明：该菌含有具有红细胞

凝集活性的物质。