由于基因载体可以运输治疗基因进人生物有机体内进行治疗，羧甲基纤维素钠接枝共聚物的合成与表征，而基因载体的安全和高效性是影响 基因治疗效果的关键因素，因此寻找安全、高效率的基因载体备受关注[1].相对于病毒载体，非病毒 基因载体具有可预测的安全性、种类多样、可直接生产及定量控制运载量等优势.但这些载体依然存 在基因转染效率低、不能将治疗基因靶向转运到目标细胞及其核内等问题[2].传统的高分子基因载体 一般都是聚阳离子，可以与脱氧核糖核酸（DNA)通过静电作用形成纳米复合物，从而实现基因的转 载[3,4].但这种纳米复合物结构相对无序，比较难以控制，因此稳定性较差.如果将DNA和高分子相 结合形成嵌段的杂化高分子，再进行自组装，形成结构可调、高度有序的多功能纳米复合物，有望提 高基因的转染效率[5]. DNA和高分子的杂化物将具有很好的稳定性及良好的生物相容性和生物活性, 在体内不产生毒副作用[6,7].本课题组对DNA的功能化修饰和自组装进行了大量研究，并取得一定的 成果[8〜13].

目前，DNA与高分子进行杂化的方法主要有3种：（1)将DNA末端修饰成可聚合基团，再利用引 发剂引发含有DNA的单体进行聚合，得到侧链接枝DNA的共聚物[14，15]; (2)将已合成好的高分子链 通过活性基团直接连接到有活性末端的DNA上，例如合成丙烯酸侧链接枝单链DNA齐聚物（ODNs) 和N，N-二甲基丙烯酰胺共聚物接枝ODNs的杂化接枝共聚物[16，17]; (3)在高分子链上引人活性位点， 再以高分子链为骨架，利用固相合成将DNA合成单体逐步连接到高分子链上，最后脱保护得到接枝 DNA分子链的高分子接枝共聚物[18].与第2种方法相比，第3种方法提到的固相合成方法提高了接枝 效率，但固相合成的DNA分子链长度不等，而且许多合成的链是错误的.因此，如果将该材料用于检 测DNA或转载基因，效果并不好[19].聚合酶链式反应（PCR)是一种分子生物学技术，可看作生物体 外的特殊DNA复制，用于扩增特定的DNA片段.Herrmann等[5,20]对DNA与高分子通过化学键连接形 成杂化嵌段共聚物做了大量研究，并证明了 PCR是实现与高分子连接的ODNs扩增的有效途径，解决 了第2种方法中DNA片段比较短和第3种方法中DNA序列不稳定的问题.

羧甲基纤维素钠（CMC)在水中具有良好的溶解性，无毒且具有良好的可降解性和生物活性以及人体相容性[21];而且CMC的分子链上众多的羧基可以用来修饰，适合作为与DNA结合的原料.但水 溶液中纤维素上的羧基活性不足以与DNA上修饰的氨基反应，需要使用活性酯活化羧基促使酰胺键 的生成.因此，本文以CMC作为接枝共聚物主链，用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)活化CMC,然后与5'端有氨基修饰的单链DNA齐聚物（ODNs-NH2)反应，得 到CMC的侧链上接枝ODNs的共聚物，并以其为引物，通过PCR得到CMC侧链上接枝DNA的共聚 物，采用傅里叶红外光谱仪和凝胶电泳实验对产物进行了初步的表征.

1实验部分

1.1试剂与仪器

CMC(Mw = 2.5xl05, DS = 1.2)，EDC和N-异丙基乙二胺，羧甲基纤维素钠接枝共聚物的合成与表征，国药集团化学试剂有限公司；NHS，阿 拉丁公司；ODNs-NH2(PCR 上游引物，Mw = 8235,碱基序列为 5'NH2-GTC ACC AGT GCA GTG CTT GAT AAC AGG 3')、PCR 试剂盒、ODNs’（PCR 下游弓丨物，碱基序列为5'GAT GAC GCA TCC TCA CGA TAA TAT CCGG3')、Lambda DNA和1000 bp DNA Marker P，生工上海生物工程有限公司；PCR纯化试 剂盒，德国Qiagen公司；1000 bp DNA Ladder■，碧云天生物技术研究所.

5334型PCR扩增仪，德国Eppendorf公司；DYY-6C型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂； KODAK Gel Logic 2200型凝胶成像仪，日本柯达公司；Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR)， 美国Nicolet公司.

1.2 CMC-g-DNA接枝共聚物的合成

合成路线如Scheme 1所示.

首先参照文献[22]方法制备NHS-CMC中间体，分别在中性及酸性条件下对CMC进行活化.将一 定量的CMC溶解在中性磷酸盐(PBS，pH = 7. 2)缓冲溶液中，配成2 mg/mL的溶液；将EDC和NHS分 别溶解在PBS缓冲溶液中，配成5 mg/mL的EDC溶液和NHS溶液.分别取680 ^L CMC溶液、120 ^L EDC溶液和200 ^L NHS溶液加人到2 mL离心管中，使EDC和NHS的浓度分别为0. 6和1 mg/mL， 将离心管置于25丈水浴反应24 h.将反应液用截留分子量为3x104的超滤管进行纯化，除去溶剂和未 反应的ODNs，EDC和NHS.最后将产物溶解在PBS缓冲溶液中，使活化后的CMC浓度为20 ^mol/L. 取一部分活化CMC样品，用大量乙醇沉淀；沉淀物多次离心洗涤后于25丈干燥，用于FTIR表征.

将0. 68 g磷酸二氢钾加人到15. 2 mL 0. 1 mol/L氢氧化钠溶液中，用水稀释至100 mL,配成pH = 6.5的磷酸盐缓冲溶液，同时调整EDC和NHS的质量比为1:2,即EDC终浓度为0.5mg/mL, NHS终 浓度为1 mg/mL,然后按相同的方法进行CMC的活化.

取100 ^L活化后的CMC溶液，加人100 ^L浓度为100 ^mol/L的ODNs-NH2溶液（pH=7. 2)和

3^L N-异丙基乙二胺，使CMC与ODNs的摩尔比为 反应结束后，用截留分子量为3xl04的超滤管对产 物进行纯化，得到CMC-g-ODNs接枝共聚物.

将CMC-g-ODNs接枝共聚物作为PCR过程的 上游引物，通过设计下游引物，以Lambda DNA为 模板，按照图1所示过程，可以得到DNA长度为 1300个碱基对（1300 bp)的CMC-g-DNA接枝共聚 物.PCR过程结束后，用PCR纯化试剂盒对产物进 行纯化.向反应液(50 ^L)中加人250 ^LPBS缓冲 液，然后将PCR产物和PBS的混合液加人2 mL的 纯化柱中，以1.3x104r/min离心60s，除去收集管 内的液体，即短片段DNA.向纯化柱内加人750 ^L PBS-EDTA缓冲溶液（PE，含有乙醇使DNA沉淀）， 以1. 3x104 r/min转速离心60 s，洗去杂质.除去收 集管内的液体，再次将纯化柱在1. 3 x104 r/min下 离心60 s，除去残留液并使残留的乙醇充分挥发. 将纯化柱插人到干净的1. 5 mL离心管内，加人60 ^LEB(PCR试剂盒自带）缓冲溶液中，静置1 min 后，离心60 s(1. 3x104 r/min)，最后将离心管内的 产物溶液在-20丈下保存.

1.3凝胶电泳实验

用质量分数为3%的水平式琼脂糖凝胶电泳检测CMC-g-ODNs.分别用质量分数为1%的水平式琼 脂糖凝胶电泳和质量分数为5%的垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征CMC-g-DNA产物.

2结果与讨论

2.1 FTIR 表征

羧酸一旦成盐，形成羧酸根负离子（, 2个C=0键相同，羧甲基纤维素钠接枝共聚物的合成与表征，因而有对称和反对称伸缩振动2 个吸收带.CMC在不同条件下活化前后的红外光谱如图2所示.可以看出，未活化的CMC在1608和

1425 cm-1处有CMC-Na分子中羧酸钠盐中羧酸根 负离子的特征吸收峰，羧酸的钠盐在1650〜1850 cm-1处无C = O双键的特征吸收峰；1118 cm-1处 为纤维素中醚结构C一O—C的伸缩振动吸收峰; 1060 cm-1处为纤维素醚yS-(1，4)二苷键的特征吸收 峰.因此，如果活化成功获得中间产物，则在 1650〜1850 cm-1处会有C = O的特征吸收峰出现. 由图2可见，在中性和酸性条件下，1720 cm-1处均 出现叔酰胺中酯基的特征吸收峰，1326 cm-1处为 C一N键的特征吸收峰，说明生成了 CMC和NHS 的中间产物.图2谱线b中1654 cm-1中应为

Scheme 1中第一步反应CMC与EDC生成的中间产物中C N的特征吸收峰，表明在中性条件下，只 有部分羧酸盐被活化，而在酸性条件下对CMC的活化效果更好.

2.2凝胶电泳

对于相同碱基对数的DNA,在同样浓度的水平式琼脂糖凝胶电泳中迁移速率是相同的.由图3可 以看到，在中性条件下活化时，接枝在CMC上的 ODNs(泳道3)相对于未接CMC的ODNs(泳道2)

有一定滞后.而在酸性条件下活化后，接枝在CMC 上的ODNs的条带出现拖尾现象（泳道4)，说明 CMC上接枝了若干个ODNs，同时也说明CMC在酸 性条件下的活化效果更好，表明CMC侧链上的羧 基活化率更高.

将所得CMC-g-ODNs用于PCR过程，产物分别 用质量分数为设的水平式琼脂糖凝胶电泳和质量Fig. 3 Picture of 3% horizontal agarose gel electropho-

分数为5%的垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行resis of 1000 bp DNA Marker P ( lane 1 )，

检测.琼脂糖凝胶电泳的结果如图4 ( A)所示.unreacted ODNs (lane 2)，CMC-g-ODNs (lane

图4(A)中泳道3中出现了 2个条带，与对照组（泳3, CMC activated at pH = 7. 2 ) and CMC-g-

道2)在同一水平线上的条带为ODNs进行PCR后〇DNs(lane4, CMC activated at pH = 6.5)

得到长度为1300 bp的DNA，而在其下方的颜色较浅的条带应为CMC-g-DNA产物.表明CMC-g-ODNs (泳道4)在1%琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率大于CMC-g-DNA产物.而在垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳[图4(B)]中，泳道2也出现了 2个条带，不同的是产物条带出现的位置与对照组相比出现了 滞后.

由于聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在引发剂过硫酸铵及催化剂 N,N,N',N'-四甲基二乙胺作用下形成的三维网状结构的水凝胶，而聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结 构，因此可以起到分子筛的作用，对样品进行分离.对于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA在其中的移 动速率只与分子量的大小有关，因而变性凝胶电泳可以起到分离不同大小DNA的作用.1300 bp的 DNA只有1个条带，如图4(B)中的对照组（泳道1)所示；与CMC接枝后，出现了 2个条带，如图4 (B)中泳道2所示，与对照组在同一水平线上的为ODNs进行PCR后得到的1300 bp DNA,泳道内上 方的条带为CMC-g-DNA产物.CMC-g-DNA迁移速率相对于对照组出现滞后，与琼脂糖凝胶电泳结果 相反，说明CMC接枝上DNA后，DNA的分子量增加.同时说明图4(A)泳道2中的浅色条带不是由于 未PCR的CMC-g-ODNs的引起的，而是CMC-g-DNA产物.图4中CMC-g-DNA产物未出现拖尾现象且 条带颜色较浅，说明接枝在CMC上的ODNs PCR成功率不够高，羧甲基纤维素钠接枝共聚物的合成与表征，可能每个CMC上只有一个ODNs扩 增.可见，通过琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，证明合成出了 CMC-g-DNA产物，并且 在1%的琼脂糖凝胶电泳中，CMC使得1300 bp DNA的移动速率加快，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中， CMC使1300 bp DNA的移动速率减慢.

3结 论

利用化学合成和生物合成的方法制备了 CMC-g-DNA接枝共聚物，并对中间产物和最终产物进行 了表征.结果表明，CMC在酸性缓冲溶液中比在中性缓冲液中的活化效率更高.凝胶电泳的结果表 明，接枝上CMC的DNA迁移速率发生了改变，证明最终产物的生成，同时也说明CMC所带的负电荷 可以加快1300 bp DNA在1%水平式琼脂糖凝胶电泳过程中的迁移速率，减慢其在垂直板变性聚丙酰 胺凝胶电泳中的迁移速率.