氮源浓度对黄原胶流加发酵过程的影响：

氮源浓度对黄原胶流加发酵过程的影响，黄原胶作为最重要的微生物多糖在食品、采油等工业中得到广泛应用.黄原胶生产过程 的经济性取决于黄原胶发酵的最终浓度，该浓度与生物反应器中诸多环境因素密切相关，其 中氮源的种类及浓度对发酵过程均有重要影响，主要是影响细胞生长并通过细胞量的变化影 响黄原胶合成.氮源可分为有机氮源和无机氮源.早期研究表明有机氮源要优于无机氮源， 常用 DDS (Distiller’s Dried Solubles)、CSL (Corn Steep Lique)、蛋白腺等.对浓度影响的 研究也主要是针对有机氮源[|].但有机氮源组成复杂，常含某些未知因子影响细胞生长. 此外，有机氮源还不利于黄原胶的分离回收.因此以组成确定的无机氣源考察氮源浓度对发 酵过程的影响更好.

对氮源浓度变化影响的考察主要有两种方法：一种是基于限制营养技术，即固定其他培 养基组分，以氮源为限制底物考察其浓度变化对发酵的影响[1'21;另一种则是考虑到多种组 分间的相互作用而采用统计的方法对多个组分同时进行优化[3,4].后一种方法实验量很大， 常在摇瓶中进行，而对高粘度非牛顿物系摇瓶难以达到良好的混合，对实验条件无法严格控 制.因而以第一种方法在反应器中考察氮源浓度变化对发酵过程的影响更好.然而前人在此 方面工作还有很多不足：一是往往只简单地通过对最终结果的比较得到结论而缺少对过程的 深入分析；二是只对间歇发酵进行研究，而对生产中更具优越性的流加发酵中最佳氮源浓度 的确定却无人进行讨论.

1实验方法

菌种为XawAowomw mNRRL- B- 1459.从活化斜面上接种后在摇床上28X: 下培养24h.再接种到发酵罐中，接种量8%.发酵培养基组成：葡萄糖为40gM.一 MgS04.7H20为 0.25g   L 'K2HPO4 为 0.5g.L、柠檬酸为 2g.L-1, CaC〇3 为 0.038十~、 以（NH»)2S04为氮源，其浓度为（l~5)g*L'

发酵罐为-自动控制通气搅拌罐，总体积7 L，工作体积4 L.空气由空气压缩机经粗 细两级膜过滤器进入罐内，经一环形管气体分布器鼓出.出气大部分放空，小部分进人呼吸

仪测量氧及二氧化碳含量.温度控制在28 C, pH值6.8~7.0.转速、溶氧可手动调节测量. 搅拌桨为两个六叶透平桨，直径120_，桨径比为0.67.采用该桨可使在较大的黄原胶浓 度范围内反应器中保持较好的混合状况.采用逐次流加的方法控制糖浓度，流加葡萄糖溶液 浓度为225 g’L — 1,每次加人200 ml,使发酵液中糖浓度维持在（10〜20) g^L1. —般每批发酵 只需进行2〜3次流加，黄原胶浓度就不再增加.

发酵过程中每隔4 h左右取出10 ml样品，适当稀释后在10 000#下离心20 min,细胞 沉淀加水悬浮后测定其吸光度由标准曲线确定其浓度.取lml上清液用DNS法测糖，其余 加入二倍体积酒精沉淀过滤烘干称重以确定黄原胶浓度.

2结果与讨论

不同初始氮源浓度下的细胞生长及黄原胶合成曲线如图丨所示.由图1可看出，氣源浓 度增加时，生长期延长，最大细胞浓度由3g*Ld增加到9g*Ld.而黄原胶浓度则在氮源 为41 (纯氮0.85 g'L1)时最大，55 h时即已超过40 g‘L—1.此时糖已流加两次，发酵液

中残糖约5 ^L1,总耗糖约50 g^L1,得率达0.8,优于间歇发酵的结果，氮源浓度对黄原胶流加发酵过程的影响，与前人流加发酵结 果相比，发酵时间也大大缩短[5’6].此后虽然糖继续消耗，胶浓度却不再增加.在更高的氮 源浓度时黄原胶浓度反而降低，而糖消耗却仍很多，因而得率大大降低.作者的结果与前人 所得最佳氮源浓度比较见表1.

前人在反应器中对氮源浓度影响的研究得到了不同的结论，作者通过比较发现这主要与 他们所用的氮源种类及研究的浓度范围有关，下面分别予以讨论.

(a) Growth(b)Production

Fig. 1 Growth and xanthan production at different initial N - source concentrations Initial N - source concentration1 :■ 1.5; LI 3.0; <>4.0; ^4.5;〇5.0

Table 1 The best N - source concentration in previous studies

N ~ .source1rw/g*L1 Bioreactort>/g*L 1-S-r/g*L 1vwReference

CSL401.45 L fermentor21(69h)550.38[II

叫叫1. 1440.4shake flask10200.5[3J

(NH4)2S〇43.30.7shake flask16300.53[4]

nys8.00,320 L fermentor17(72 h)22.50.76[7]

glutamic acid2.250.4shake flask33(96 h)400.82[8]

续表

N - scmrcecN/g*L_lcm'/g-L 1BioreactorcP/g.L_lST/g-L 'yp/sReference

peptone5.00.8fermentor17(42 h)22.50.75[9]

ammonium salt1.0-1.25~shake flask28(72 h)400.7[10]

NH4C!0.3420.1155 L fermentor17.5(65 h)350.5[11]

(NH4)2S〇44.00.857 L fermentor40(55 h)500.8this article

CM: N-source concentration; CNT： total nitrogen concentration; rp： xanthan gum concentration; ： total C~ source tx^nsumed; Vp/s: yield.

(l)氮源浓度增加则细胞浓度增加，产物合成速率加快，黄原胶得率提髙[2,8].氮源 浓度较低时一般得此结论，唯独Kennedy[l]以CSL为氮源在髙浓度下仍得此结论.这可能 是因CSL中很大一部分是碳源而与糖同时被利用，由此亦可表明应采用无机氮源进行研究.

(2)中等浓度时氮源浓度升高则细胞浓度和合成速率均提高，发酵时间缩短，但胶得率 却降低[1，12],对此，M0mine[l2]解释为细胞增多使得用于细胞生长及维持的糖增多，因而用 于合成黄原胶的糖减少使得率降低.此时最终胶浓度受初糖浓度限制，而作者采用流加发酵 则可避免此限制，氮源浓度对黄原胶流加发酵过程的影响，而且后期流加的糖大多用于产胶，即可达到更髙的得率.

(3)氮源浓度再升高时，虽然细胞浓度继续增加，胶合成速率及得率却均降低.作者的 实验结果即是如此.尚无人对高氮源浓度时出现这种结果的原因进行深人分析.

10 20 30 40 50 60 70020 4060

//ht/h

(a)OUR(b) Production rate

Fig. 2 OUR and xanthan production rate at different N ~ source concentrations Initial N - source concent ration/g* L 1；n3.0;〇4.0;A4.5; 〇5.0

不同氮源浓度下的氧消耗速率(OUR)与黄原胶合成速率(7?p)曲线如图2所示.产物合成 速率均呈峰形，在达到一最大值后随发酵过程的进行而降低，且浓度为5 g^L1时速率要低 于浓度较低时的结果.通过对原始实验数据的分析，作者认为氧限制和死区是导致低合成速 率的主要原因.黄原胶发酵后期粘度很大，难以保证混合良好，造成氧供应不足.黄原胶发 酵的临界溶氧浓度约为20%[12]，而当氮源浓度大于3g*LM时，发酵经过（30~40)h后溶 氧即降到20%以下，甚至于为零，表明发生了氧限制.此外由于非牛顿流体的剪切稀化特 性，壁附近某些区域剪切应力很低，可能小于流体屈服应力而使流体根本不动而成为死区. 作者通过冷模流动显示（Flow Visualization)实验证实，在黄原胶浓度大于20 时壁处局 部区域出现死区.多篇文献报道在黄原胶发酵反应器中有氧限制和死区出现[13，14].死区溶 氧值(DO)总为0,无法供氧，因而死区和氧限制均可归结为氧供应能力的不足.此时OUR 由设备供氧能力决定，因而在不同氮源浓度下OUR曲线相差不大.而氧首先应保证细胞维 持生命的需要，在髙氮源浓度下细胞浓度较髙，导致维持耗氧增多，使得用于合成的氧减 少，因而合成速率降低.同时有氧限制发生时即使有足够的糖也不能使它们充分用于产胶， 因而用于产胶的糖减少，而耗于维持的糖基本不变，导致得率降低.

氧限制的避免须从两方面考虑：-是通过改进设备及操作条件消除死区提高供氧能力； 二是限制细胞浓度控制氧需求，但为T维持较高合成速率细胞浓度又不能过低，氮源浓度对黄原胶流加发酵过程的影响，这样最佳细 胞浓度便由设备的供氧能力决定.而细胞浓度常由氮源控制，此时最佳氮源浓度便由设备决 定.这一点以前关于氮源浓度影响研究的文献均未提及.

3结论

(1)细胞浓度随氮源浓度增加而增加，而黄原胶合成却在一定细胞浓度下达到最优.

(2)设备供氧能力限制是高细胞浓度下胶合成速率及得率降低的主要原因.

(3)氮源浓度对黄原胶合成速率（影响发酵时间及功耗）、最终胶浓度（影响下游分离费 用）、得率(影响原料成本)均有重要影响，必须结合具体设备进行优化.

(4)通过设备改进供氧，氮源浓度的优化以及流加控制糖浓度，使黄原胶浓度在55 h 内超过40g+ l,优于前人结果.本研究结果对黄原胶工业生产生物反应器的设计及操作 条件优化具有重要指导意义.

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