杜氏盐澡（Dunaliella salina)是_种高含卜- 胡萝卜素的广盐性微藻，已经在我国及美、澳、日、以 色列等国实现了大规模培养,形成了较大规模的微 藻产业E-a。为监测盐藻细胞生长状态，在科研和 生产中常常以细胞数目作为生长指标^4。因此计 数盐藻细胞数对了解细胞的生长状态、生物量测定 等都十分重要6-7]。目前常用的盐藻细胞计数方法 采用血球计数板直接计数法，该方法较简便、快捷， 但结果不够准确。因为盐藻呈单细胞，椭圆形，细 胞前端长出两条等长的鞭毛，约是体长的1. 2 倍6-9。活性盐藻细胞计数法的研究在水中能自由游动的特性造成了计数误 差。在传统的方法加盐酸计数时，由于细胞处于死 亡状态，所以藻细胞数目基本不变。缺点是死活细

胞无法区分，使计数结果偏高。

文章对血球计数板直接计数法进行改进，在菌 液中加入具有粘性的羧甲基纤维素钠，消弱了藻细 胞在液体中的游动性，同时又是存活状态。改进后 的血球计数板直接计数法能准确、可行的用于盐藻 活细胞计数。

1材料和方法 1.1藻种的培养

藻种由内蒙古吉兰泰生物工程公司提供，培养 方法见文献3]。

1.2药品

羧甲基纤维素钠（CMC) {(C8H„NaO7) n,粘度: 300 mPa • s ~800 mPa • s},分析纯，北京东环联合 化工厂生产。

1.3羧甲基纤维素钠溶液浓度对藻细胞的运动性 影响

当盐藻细胞培养达到一定浓度的时候，取10mL 藻液，加入10 mL体积的不同浓度（6 g/L, 9 g/L, 12 g/L,15 g/L,18 g/L,21 g/L,23 g/L,26 g/L )的 羧甲基纤维素钠溶液，摇匀。活性盐藻细胞计数法的研究用无菌滴管吸取少量， 从盖薄片边缘滴一小滴。在显微镜下静置5 min后 观察，以不加羧甲基纤维素钠溶液为对照组。

1.4羧甲基纤维素钠对藻细胞活性的影响

取加过羧甲基纤维素钠的剩余盐藻培养液继续 培养，定时取样在显微镜下观察其生长状况。

1.5藻细胞显微镜计数方法

对三种盐藻样品的藻液进行计数。1号样品为 8%盐度,2号样品为13%盐度,3号样品为18%盐 度。取10 mL藻液，加入10 mL的23 g/L的羧甲基 纤维素钠溶液，摇匀。用无菌滴管吸取少量,从盖薄 片边缘滴一小滴。在显微镜下静置，静置不同时间 2 min、min、min、min、10 min 和 12 min 后计数, 每个样品重复计数三次，取平均值。以加盐酸计数 (3 mol/L)和不加羧甲基纤维素钠溶液为对照组。

2结果

2.1藻细胞的运动性

显微镜下盐藻细胞的形态见图1。在藻液中加 入不同浓度的羧甲基纤维素钠溶液，藻细胞在显微 镜下静置6 min后，细胞在血球计数板计数室内的

运动状态观察结果见表1和图2。

图1加CMC培养后的盐藻细胞 表1藻细胞在计数室内的运动状态观察结果

CMC/

(g.L-1) 69121518 21 23 26

状态移动快移动

较快移动

较快移动慢个别极个别

移动移动不移动不移动

由表1中可以看出，加入低于12 mg/mL羧甲 基纤维素钠时,盐藻细胞在计数室内的移动速度比 较快，无法计数。当加入浓度达到23 mg/mL时，盐 藻细胞基本处于静止状态，个别盐藻在原地打转，限

制了其在小方格之间的跃迁。在增大羧甲基纤维素 钠的浓度时，盐藻细胞静止不动，但是藻液粘性大, 给配制和定量溶液带来困难，影响计数的准确性。

 

图2未加CMC计数板中方格中藻细胞的分布

由图2、图3、图4和图5中可以看出，不加羧甲 基纤维素钠时,盐藻细胞在计数室内的游动速度比 较快,数量逐渐减少，逆光向着计数板的边缘集中。 当加入浓度达到23 g/L时，盐藻细胞基本处于静止 状态，藻细胞在计数室中方格内与计数板的逆光侧 边缘的分布基本相近。说明在盐藻细胞计数时加入 羧甲基纤维素钠是可行的，最佳加入羧甲基纤维素 钠的浓度约为23 g/L。由图6可得加盐酸之后，活性盐藻细胞计数法的研究藻 细胞已处于死亡状态，计数时不移动。

 

图3未加CMC计数板逆光侧边缘藻细胞的分布

 

图4加CMC计数室中方格内藻细胞的分布

 

图5加CMC计数板逆光侧边缘藻细胞的分布

 

26

盐业与化工 

 

图6加盐酸计数室中方格内的藻细胞

2.2藻细胞显微镜计数结果

三种不同盐度的藻液的盐藻细胞计数结果见表

2、图7〜图9。

表2盐藻细胞计数结果（个/中方格)

时间/

min1号样品2号样品3号样品

对照对照 1 2加

CMC对照

1对照

2加

CMC对照对照 1 2加

CMC

0702320421716431312

2642220481716381312

4672221301716261312

6432221371716241311

8222221261716201311

10152220221716181311

12后022202171551311

注：对照1为未加CMC,对照2为加盐酸

以上实验数据可以看出，盐藻在不加入羧甲基 纤维素钠进行计数的时候，个数变化呈现不规律变 化，随着时间的延长，中方格中盐藻的数目在逐渐减 少，直到最后在中方格的盐藻细胞数目为零，藻细胞 迅速聚集到逆光的_边;并且在计数的过程中，盐藻 移动的速度还是比较快,这使得无法对其进行计数。 见图7 ~图9中的对照1变化趋势。

 

 

 

在加盐酸计数时，由于细胞处于死亡状态，所以 藻细胞数目基本不变。缺点是死活细胞无法区分， 使计数结果偏高。见图7 ~图9中对照2的变化趋 势。

由图7 ~图9中加CMC的变化趋势可知，在加 入羧甲基纤维素钠以后，可以充分看到盐藻在原地 打转,保持相对静止的状态，并且随着时间的延长， 可以看到其在25个中方格里的盐藻数目没有太大 的变化，在12 min以后，中方格的盐藻数目仍然没 有变化;并看到在血细胞计数板的两边也没有藻细 胞的累积，经过多次的实验，活的盐藻细胞的数目始 终没有太大的变化。并且在不同盐度培养下的盐 藻，颜色有明显的区别，低盐度下培养的偏绿，而随 着盐度的增加逐渐显偏现浅红色，并且随着盐度的 增加，盐藻的的移动速度比较小，但是经过较长的时 间，对未加羧甲基纤维素钠的培养液来计数,盐藻也 会移向_边。而在加入其之后，盐藻细胞的数目随 着时间没有太大的变化。

2.3藻细胞活性检测

取加入羧甲基纤维素钠的盐藻细胞加入培养液 后进行培养，活性盐藻细胞计数法的研究加有羧甲基纤维素钠的盐藻培养液中 的盐藻细胞依然存活，在显微镜下观察其运动性恢 复正常，与正常培养的细胞来说，形态完整没有明 显变化。这就充分说明加入的羧甲基纤维素钠对盐 藻的生长没有太大的影响。

3结论

改进后盐藻血球计数板计数法的最佳加入羧甲 基纤维素钠的最佳加入浓度是23 g/L,通过对不同 盐度下培养出的盐藻进行计数，说明了羧甲基纤维 素钠溶液能有效的限制盐藻细胞的运动。该计数方 法的特点是既保持了其原有的快速和简便的优点， 又具有区分死活细胞的优点。可以用这种方案来解 决血细胞计数法难以计数活的盐藻细胞的难题。并 

广泛应用于藻细胞计数的工业生产实践和科研领 域。