聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究:
聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,酸性乳饮料由于其独特的风味及保健功能而广受欢迎，近几年在国内市场上发展也非常 迅猛。牛乳蛋白在酸性条件下的变性沉淀和乳脂肪上浮一直是影响酸性乳饮料生产及开发的 关键性问题。因此，近年来对多糖类亲水胶体与乳蛋白的相互作用，以及对最终产品稳定性 的研究成为食品科学研究的热点。目前对应用于酸性乳饮料的多糖研究较多的是果胶、可溶 性大豆多糖、海藻酸丙二醇酯，而对其他多糖研究较少。而且大多数研究者都采用脱脂乳体 系作为研究对象，而对全脂乳体系则鲜有研究。本文采用全脂酸性乳体系为研究对象，研究 了羧甲基纤维素钠（CMC)、羧甲基可德胶（CMc)、玉米纤维胶（CFG)三种聚阴离子多 糖对酸性乳饮料的稳定作用。
由于CMC溶液的流变学性质是其应用的一个重要特性，我们首先研究了其溶液的流变 学性质。CMC溶液呈现假塑性，溶液的粘度随剪切速率的升高而降低，溶液的储能模量G’ 和损耗模量G”都对频率有很强的依赖性。通过监测稀释全脂乳体系中的粒子粒径和zeta 电位，发现当体系pH小于5.2时，CMC因静电作用吸附在酪蛋白胶粒表面。CMC在酪蛋 白表面的吸附层可以提供空间位阻作用和静电排斥作用，是维持酪蛋白胶粒在酸性条件下稳 定的主要因素。酸性乳体系的稳定性与CMC的添加量、分子量、取代度等密切相关。CMC 的添加量越高、分子量越大、取代度越高，酸性乳体系稳定性的各项指标越好，其稳定性也 越好。全脂乳体系与脱脂乳体系相比，全脂乳体系的粒径更大，但他们在酸化过程中的粒径 变化和zeta电位变化一致，说明乳脂肪的存在并不影响乳蛋白的结构变化，也不影响CMC 在酪蛋白表面的吸附。
CMc与CMC有相似的化学结构，他们的化学性质也应该相似。本文将可德胶（Curdlan) 羧甲基化得到CMc，测定其取代度为0.87。CMc水溶液也呈假塑性，粘度随剪切速率的升 高而降低，随浓度的増加而升高。与CMC类似，当体系的pH小于5.2时，CMc也开始吸 附在酪蛋白胶粒表面，提供空间位阻作用和静电排斥作用从而稳定酪蛋白胶粒。高添加量、 高分子量均有利于其对酸性乳饮料的稳定。CMc与CMC相比，CMc对酸性乳饮料的稳定 效果不如CMC好，这可能是由于其分子链的刚性不如CMC强。
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CFG不同于CMC和CMc，CFG溶液粘度基本不存在剪切速率依赖性，具有类似于牛 顿流体的特性。此外，CFG也不像CMC和CMc—样能吸附在酪蛋白胶粒上提供静电排斥 效应和空间位阻效应，其不能作为酸性乳饮料的稳定剂。
第一章绪论
1.1引言
近年来，随着我国人民生活水平的不断提高、健康意识的不断増强，乳制品市场日益壮 大。改革开放以来，我国的奶类产量由1985年的289万吨増长到2008年的3781.5万吨， 増长了 13倍。我国乳品工业的长足进步，不仅体现在乳制品产量上的快速増长，还体现在 对乳制品的消费理念及消费结构上的改变。过去由于对乳制品的认识不足、消费习惯以及收 入较低等原因，乳制品仅被视为一种营养品，供一些特殊人群使用，如婴儿、病人、体弱者 等，近年来这种消费群体结构己经发生变化。乳制品的消费呈现出全家共同消费的趋势，成 为许多家庭日常生活中经常消费的一种重要营养食品。过去我国居民对乳品的消费一直以乳 粉为主，近年来这种消费状况也发生了改变。从乳制品的消费结构看，液态乳的消费量上升 较快，所占的比重逐年増大。
液态乳的种类复杂，花样繁多，按其pH值可分为中性乳和酸性乳。酸性乳饮料酸甜适 中，爽滑可口，不仅保留了酸奶的特殊风味，还具备了酸奶的大部分营养和功能，且价格适 中，因而在我国深受广大消费者的青睐，特别是少年儿童。酸性乳饮料在我国液态乳市场上 迅速占据了相当的份额，并且每年保持20%左右的増长速率。酸性乳饮料(acidified milk drink，简称AMD)是一种以鲜奶、复原奶和豆奶为主要原料，添加其他甜味剂、稳定剂、乳 化剂和色素等辅助原料，利用活性菌进行乳酸发酵或者直接添加果汁、食品酸（乳酸、苹果 酸和柠檬酸等）辅助原料调配获得的pH介于3.8到4.2 (低于酪蛋白的等电点4.6)，蛋白含 量大于1%的含乳饮料 。为了满足消费者对酸性乳饮料日益増长的需求，乳制品企业致力 于生产和开发形式多样的酸性乳饮料产品，但脂肪上浮和蛋白质沉淀却一直制约着酸性乳饮 料产品的生产和开发，而在产品中添加稳定剂可以有效解决产品的稳定性问题。因此，近年 来对多糖类亲水胶体与乳蛋白的相互作用，以及对最终产品稳定性的研究成为食品科学研究 的热点。
1.2牛乳的组成
牛乳是一种非常复杂的胶体分散体系，牛乳中主要成份是：水、乳脂肪、乳蛋白质、乳 糖和矿物质（无机盐类)，牛乳还含有其它微量成份，例如：色素、酶类、维生素和磷脂（具 有与脂肪相似性质的物质），以及气体。牛乳中除去水和气体之外的物质称为干物质（DS) 或乳的总固体含量。牛乳体系中水是主要成分占87%，总固体占13%，固体或悬浮或溶解 于水中，取决于这些物质在水相中的不同分散系统。在牛乳中，无机盐在水中以溶解状态存 在，蛋白质以胶体状态悬浮在溶液中，脂肪形成乳浊液分散于乳中。牛乳中各物质含量和分 布状态如表1所示。
表1-1、乳的理化状态 Table 1-1 Physical and chemical state of milk
物质平均值（％)乳状液胶体溶液真溶液
水87.0
脂肪4.0x
蛋白质3.5x
乳糖4.7x
矿物质0.8x
1.2.1乳脂肪
乳脂肪是牛乳中含量最多的固体，它以小球或小液滴状分散在乳浆中。其球径在0.1〜 20um(1um=10-6m)之间，平均球径3〜4um，每毫升牛乳中，大约有150亿个脂肪球。每 一个乳脂肪球外包一层薄膜，厚度约5-10nm(1nm=10-9m)。脂肪球被膜完整包住。膜的构成 相当复杂。乳脂肪组成包括：三酸甘油酯（主要组份）、甘油酸二酯、单酸甘油酯、脂肪酸、 固醇、胡罗卜素（脂肪中的黄色物质）、维生素（A、D、E、K)和其余一些痕量物质。球 膜组成包括：磷脂、脂蛋白、脑苷类、蛋白质、核酸、酶、痕量元素（金属）和结合水。应 注意的是脂肪球膜的组成和厚度都不是不变的，因为球膜的成份总是与周围乳浆物质不断进 行交换。
由于乳脂肪球不仅是乳中最大的粒子，而且是最轻的粒子（15.5°C时比重0.93g/cm )， 所以当乳在奶桶中静置一段时间，乳脂肪倾向于浮在乳的表层。脂肪球上浮速度遵循斯托克 斯(Stokes)定律，其中小的脂肪球形成稀奶油层较慢。在一种叫做凝聚素的蛋白质作用下，
乳脂肪因凝聚作用而加快了上浮，这种状态下的上浮速度要比单个脂肪球上浮得快，这种 凝聚作用很容易因加热，机械作用而破坏，在65°C/10min或75°C/2min加热条件下，该凝 聚素即失活。
1.2.2蛋白质
蛋白质是食物中的基础组份，我们食入的蛋白质经肝脏和消化系统的作用，被分解为较 简单的化合物，这些化合物再被送到身体的细胞，成为构成细胞蛋白质的物质。蛋白质也是 牛乳中的一个关键成分，在乳品工业中非常关心的一个问题是乳蛋白质在乳中的存在状态， 蛋白质胶粒的稳定性(分散、乳化)、不稳定性(凝聚、沉淀）等现象，都直接与乳蛋白质的 性质有关。牛乳中大约含0.5%的氮，其中95%为乳蛋白质，5%为非蛋白态氮。蛋白质 在牛乳中的含量为3.3%-3.5%。按氮的分布测定法，乳中所含蛋白质如图1-1所示。
图1-1类牛乳蛋白质分 Figure 1-1 Classification of milk protein
几百种蛋白质，多数含量较少，根据蛋白质的化学或物理性质和其生理功效可有各种不 同的分类方式。古老的方式是将其分为：酪蛋白、乳白蛋白和乳球蛋白。表2所示为按现代 分类系统分类的蛋白质的节略名单。为简便起见，不包括那些微量蛋白质。
一、乳清蛋白
乳清蛋白这一名称常用于代表乳浆蛋白质，但这一名称应专用于干酪加工过程中产生 的乳清中的乳蛋白质。除了乳浆蛋白，乳清蛋白还包括酪蛋白碎片。在乳清中，一些乳浆蛋 白的浓度低于其在乳中的浓度。这是因为在干酪制做过程中，巴氏杀菌处理导致蛋白质热变 3 性的结果。在乳中的蛋白质可因其特性上和存在形式的最大差别分为三大类，酪蛋白在乳浆 蛋白仍形成溶液时，易于以许多形式从乳中沉淀出来；而脂肪球膜蛋白正如其名，是附着于 脂肪球表面的蛋白质。只有一些机械处理，如搅打稀奶油制做奶油时才会被剥离下来。
乳白蛋白一一乳清在中性状态下，加饱和硫酸铵或饱和硫酸镁盐析时.呈溶解状态而不 析出的蛋白质属于乳白蛋白。约占乳清蛋白质的68%。乳白蛋白又分为，
I、a-乳白蛋白：约占牛乳中蛋白质总量的3.7%，等电点pH值为5.1。
II、 P-乳球蛋白：约占牛乳中蛋白质总量的9.8%，等电点pH值为5.2。
III、血清白蛋白：牛乳中蛋白质总量的1.2%，等电点pH值为4.9。
表1-2乳中蛋白质的浓度 Table 1-1 The concentration of protein in milk
蛋白种类乳中蛋白质浓度（g/Kg)占蛋白质总量的百分数（W/W )
酪蛋白
a si-酪蛋白10.030.6
酪蛋白2.68.0
e-酪蛋白10.130.8
K-酪蛋白3.310.1
酪蛋白总量26.079.5
乳清蛋白质
a-乳白蛋白1.23.7
e-乳球蛋白3.29.8
血清白蛋白0.41.2
免疫蛋白0.72.1
其他0.82.4
乳清蛋白总量6.319.3
脂肪球膜蛋白0.41.2
蛋白总量32.7
a-乳白蛋白相当稳定，70°C时仅有6%变性，而e-乳球蛋白32%变性。a-乳白蛋白含
有4条二硫键，通过二硫健与e-乳球蛋白结合，在乳制品加工过程中经常发生分子内或分
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子间的二硫健交换反应。乳球蛋白在加热过程中，60°C时引起Cysll9与芳香族氨基酸反 应，使天然的乳球蛋白二聚体解离。乳球蛋白与a si蛋白的二硫链空换反应使乳球 蛋白与酪蛋白结合。乳球蛋白还可以与K-酪蛋白结合，这些分子之问的相互作用能够増 加热稳定性，阻止0 -乳球蛋白的聚集。
乳球蛋自一一乳清在中性状态下，加饱和硫酸铵或饱和硫酸镁盐析时，能析出而不呈溶 解状态的乳清蛋自质。乳球蛋白又分为：
a.真球蛋白：约占乳清蛋白的5.2%，等电点pH值为6.0。
b.假球蛋白：约占乳清蛋白的4.8%，等电点pH值为5.6。
乳球蛋白己分离为两个非常纯的组分，即真球蛋白和假球蛋白，这两种蛋白质与乳的免 疫性有关，也就是具有抗原作用，所以常常称为免疫球蛋白。其特征为含有己碳糖和己碳糖 胺，从血液移行到乳中，初乳比常乳中含量显著増加。中国科学院上海生理研究所的科研人 员通过大量实验和临床测试，利用初乳经巴氏杀菌冷冻升华干燥（-30 C、10KPa )制成乳珍。 它不仅有很高的营养价值，对耍幼儿有増强机体抗病能力的作用，促进其生长发育，对老年 人还具有一定的抗衰老作用。甚至在治疗某些要幼儿疾病方面都有良好作用，在辅助治疗成 年人胃炎及糖尿病等方面也有明显效果[2]。
二、酪蛋白
酪蛋白占牛乳蛋白质总量的80-82%，是牛乳蛋白质的主要成分。当脱脂乳在20° C下， pH调整到4.6时，沉淀下来的蛋白质就是酪蛋白。乳中含有4种不同类型的酪蛋白，即a,1、 如、P和K酪蛋白，它们的比例一般是4 : 1 : 4 : 1。由于乳牛遗传类型不同，乳中酪蛋白类 型的比例是变化的。同时如和a,2酪蛋白分子中的某些氨基酸也常有不同程度的改变。在pH 值为8.6的Tns甘氨酸缓冲液条件下，不同类型的酪蛋白组分可用电泳方法进行分离。知酪 蛋白分子中存在多个疏水性残基的区域和〇丝氨酰磷酸化形成的负电荷基团的簇状结构， 每摩尔分子中含有8-9个磷酸化的残基。a,2酪蛋白是4种不同蛋白质的混合物，它们的分子 中含有的磷酸化残基数不同，每摩尔蛋白质分别含有10, 11，12或13个磷酸化的残基。心- 酪蛋白对钙敏感。由于磷酸基团的存在，在pH值为7-10时，Ca2+可以将ax-酪蛋白沉淀出来。 另外，由于8.5%的脯氨酸分子分布在整个肽链中，使其中螺旋含量降低。a,2酪蛋白的电荷 区域位于8-12，56-61位残基处。p-酪蛋白分子中的大多数疏水基团形成大区域(48-209位)， 多肽链的#末端区含有亲水的氨基酸残基和5个磷酸化的残基[3]。B-酪蛋白的荷电区域位于 14-20位残基处。这种蛋白质的三级结构是紧密排列的折叠结构，其中氨基酸极性基团位于 外层表面，且被水化，内部的疏水区域由非极性氨基酸构成。因此0酪蛋白以疏水内核的疏
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水相互作用形成聚集体，而#末端的亲水部暴露于溶剂中[4_5]。K-酪蛋白与其他类型的酪蛋白 不同，含有一个磷酸化残基，同时存在寡糖基成分和一个二硫键结构。凝乳酶敏感键位于分 子的表面[6_8]
Figure 1-2 Schematic diagram showing the polymerization pathways followed in casein micelle assembly according to the dual binding model
酪蛋白是典型的含磷蛋白质，4种酪蛋白的区别就在于它们含磷量的多寡。酪蛋白是由 心1 -酪蛋白（含有8-9个磷酸化基团）、a,2-酪蛋白（含有10-13个磷酸化基团）、灸酪蛋白（含 有5个磷酸化基团）和&酪蛋白（含有1个磷酸化基团）组成。不同类型酪蛋白的结构具 有相似性，能够自行组合成聚集体，并进一步形成胶束。ay酪蛋白、a#酪蛋白、灸酪蛋白 靠疏水键的相互作用构成了亚胶束的核，并进一步结合磷酸钙形成胶束[10]。&酪蛋白具有比 较特殊的结构，它的2/3N-末端（副心酪蛋白部分）具有疏水性，而1/3的C-端（大肽端） 部分具有亲水性。因此在亚胶束中的心酪蛋白具有双重作用，它可以与知-酪蛋白形成疏水 交互作用，同时可以在胶束粒子的表面提供亲水表层。&酪蛋白的C-端突伸出胶束粒子的 表面，像“柔软弯曲”的“毛发”，构成胶束粒子的“发层”结构[11-14](如图1-2)。
酪蛋白胶束在乳中呈现为含钙、磷酸盐的络合物状态[14-17]。牛乳在正常状态下(38C)， 所有的酪蛋白成分均以分散的胶粒状态存在，胶粒的直径为20-600nm (平均120nm)，平均分 子量为108,以海绵状结构存在，这有利于蛋白水解酶进入分子的内部。酪蛋白胶束由亚基(次 单元体)组成，这些亚基(直径8-20nm)通过磷酸钙[Ca3(PO4)2]相互连接在一起。心酪蛋白位 于胶束的表面，亚基之间以疏水键和胶体磷酸钙相互作用的方式连接在一起。由于酪蛋白胶 束的存在取决于4种不同类型酪蛋白与磷酸钙之间的相互作用，因此酪蛋白胶束的组成和结 构受pH值、温度和加工条件等因素的影响。
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1.3牛乳的稳定性
1.3.1牛乳稳定原理
图1-3酪蛋白胶束间的相互作用[18]
Figure 1-3 Two interacting casein micelles.
牛乳之所以能稳定存在，主要是由于酪蛋白的稳定。酪蛋白胶粒的结构示意图见图1-3。 酪蛋白胶粒之间存在着静电排斥作用和空间位阻作用，酪蛋白胶粒之所以能够在牛乳中稳定 存在，是这两种作用的共同作用结果。酪蛋白的表面带有相同的电荷，因此胶粒间具有静电 排斥作用，但这并不是使酪蛋白稳定存在的主要因素。^-酪蛋白位于酪蛋白胶粒的表面， 它的C-端具有亲水性，使胶粒表面带有高度浓缩的水化层，当胶粒相互碰撞时，有弹性的
水化层可以阻挡其靠近[19]。此外心酪蛋白的“发层”结构（hairy layer)或称之为“聚电解质 刷”结构(polyelectrolyte brush)所提供的空间位阻效应（steric repulsion)是维持酪蛋白稳定 存在的关键因素。即当胶粒相互碰撞时，伸展于胶束表面的^-酪蛋白分子将损失构型熵并 提供排斥力，防止酪蛋白胶粒发生聚集[20-21]
总之，酪蛋白胶粒间存在三种相互作用：第一是范德华相互吸引作用，另外两种是相互 排斥作用，即静电排斥作用和空间位阻排斥作用。通过计算看到，各种相互作用的组合将形 成不同的胶束间相互作用的能量-距离曲线，并由此决定牛乳的稳定性。
1.3.2酸性乳饮料稳定性表征方法
酸性乳饮料在放置过程中易出现相分离（如颗粒沉淀或上浮），体系发生失稳。因此对 其稳定性的评判对于如何保持饮料的品质、获得较长的货架期尤为重要。但对乳饮料稳定性 评价并没有一个具体的指标，通常采用直接长期观测或者间接测定体系的某些物化性质来表 征其稳定性。何时产生相分离或沉降量达一定水平常作为货架期长短的标准。
一、直观评价（目视）及和沉降量测定
最直接简单的方法是直观评价。将酸性乳饮料在一定的环境下静置，在一定时间段（数 天至数月）直接观察其相分离情况。这种方法无疑能准确判断乳饮料稳定性，甚至直接给出 样品货架期，但耗时长且只能定性是其明显缺点，不能满足产品开发和成品检验的快速检测
需要。
将样品离心加速沉淀，然后测定沉降量，这是一种对比不同样品稳定性较快捷的方法。 从Stokes定律可知，牛乳体系中粒子的沉降速率与粒子粒径成正比，因此沉降量较低的样 品较稳定。知：^0[22]等通过测量沉降量研究了添加不同果胶量对酸性乳饮料稳定性的影响。 该法己广泛应用于乳品稳定性的研究，但是测量沉降量是一种较粗略的方法，每次需要多次 重复取平均值。
二、稳定性分析仪
垂直扫描分析仪（Turbiscan)是目前常用的稳定性测定仪，其原理是采用多重光散射技 术，通过在线监测样品透射光和背散射光强度随时间的变化，进而获得样品的沉降速率及稳 定性[23]。这一方法远较目视评判灵敏、快捷，可通过样品透过率变化的程度判断稳定性。 如Jensen等将样品池顶部2mm之内的透射率超过20%作为判定乳饮料不稳定的准则。为满 足产品开发的需要，通过离心法将样品加速沉淀，然后计算沉降速率也是一种对比不同样品 稳定性的快捷方法（相关分析仪如LUMiSizer)。虽然上述方法己广泛应用于乳品稳定性的 研究，但在实际工作中，还需针对具体产品建立沉降速率与实际货架期之间的关系。
三、动态光散射（DLS)法
由Stokes定律可知，乳体系中粒子的粒径与其稳定性密切相关。动态光散射是测量粒 径的最佳方法之一。通过粒径随时间及其它条件的变化不仅可以了解体系稳定性，更可探知 体系稳定/失稳得机理。如Maroziene等[24]采用DLS探明了不同酯化度果胶对酸性乳中酪 蛋白胶束大小的影响。丁以@1。『等[25]利用DLS获得了果胶在酪蛋白上的吸附情况及吸附层的 厚度。Du等利用DLS检测了乳体系在调酸过程中酪蛋白胶束粒径随pH值的变化，探明了 CMC与酪蛋白发生相互作用的过程。
四、Zeta电位测定
乳饮料作为一个复杂的胶体体系，其zeta电位的大小对其稳定性的影响至关重要。
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Sejersen等 通过测量zeta电位，分析了果胶含量对稳定性的影响，发现果胶含量越大，zeta 电位越负，体系越稳定。Du等[26-27]测量了含不同CMC的乳饮料中酪蛋白胶束的zeta电位 随pH降低的变化趋势，发现当pH降至5.2左右时，zeta电位开始降低；当pH降低到4.8 时，zeta电位达到最小值。酪蛋白的zeta电位在pH 5.2-4.8的范围内显著降低。这一结果表 明，带有负电的CMC通过静电作用吸附到到酪蛋白的表面，起到稳定酪蛋白的作用。
五、显微镜法
通过显微镜可直接观察颗粒在乳体系中的实际分散情况，从而预测酸性乳饮料的稳定 性。最常用方法是使用激光共聚焦显微镜（CLSM)进行观察，这需要对蛋白和脂肪分别染 色。该法能观察全脂乳饮料中脂肪与蛋白的分散状态进而对产品稳定性进行评估[28]。Du等 [26]利用CLSM观察了含不同CMC的酸性乳饮料的分散状态及其稳定性（图1-4)。从图中 可以看出，添加0.1°% CMC的酸性乳体系存在明显的聚集现象，而含有0.2°%和0.4°% CMC 的体系则表现为均一分散，说明CMC浓度越大乳体系越稳定。其它观察方法还有透射电子 显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、冷冻扫描电子显微镜(Cryo SEM)法等。如McMahon 等[29]利用TEM观察了脱脂乳体系在调酸过程中酪蛋白胶束的变化历程，对进一步解决酸化 导致蛋白沉淀的问题起到了指导作用。Martin等[30]利用SEM观察到乳体系中K-卡拉胶在酪 蛋白胶束间成丝状，并将酪蛋白胶粒串起（图2)，从而对乳体系起到稳定作用。
图1-4添加不同CMC浓度的酸性乳饮料的共聚焦显微镜照片。标尺：16叫 Figure 1-4 Confocal microscopy photos of acidified milk drinks with different CMC concentrations. Scale: 16^m
图1-5乳体系的扫描电镜照片（体系含10%脱脂奶粉，0.03% k-卡拉胶）。标尺：（A) 3000
nm; (B) 1200 nm
Figure 1-5 SEM of milk drinks systems. Scale: (A) 3000 nm; (B) 1200 nm
稳定性的表征方法还有很多，如流变学方法等。不同方法各有其特点，在实际研究工作 中，需要多方法的结合才能全面了解和把握乳体系的稳定/失稳机理和产品的实际稳定性。
1.3.3酸性乳饮料失稳机理
由于乳脂肪球不仅是乳中最大的粒子，而且是最轻的粒子（15.5°C时比重0.93g/cm3), 所以当乳在奶桶中静置一段时间，乳脂肪倾向于浮在乳的表层。脂肪球上浮速度遵循斯托克 斯(Stokes)定律，其中小的脂肪球形成稀奶油层较慢。在一种叫做凝聚素的蛋白质作用下， 乳脂肪因凝聚作用而加快了上浮，这种状态下的上浮速度要比单个脂肪球上浮得快，这种 凝聚作用很容易因加热，机械作用而破坏，在65C/10min或75C/2min加热条件下， 该凝聚素即失活。
酪蛋白是以酪蛋白磷酸钙络合物形式以胶束状态存在于乳中。在乳品工业中，很多工艺 过程都会导致这种酪蛋白体系的变化，特别是酸、受热、盐类、凝乳酶等作用，对粒子的凝 聚具有很大影响[31]。乳中的酪蛋白磷酸盐粒子与乳浆之间保持一种不稳定的平衡。酪蛋白 在溶液中主要以其表面K-酪蛋白提供的静电排斥作用和空间位阻作用保持稳定状态。4种酪 蛋白通过镁和钙二价离子结合，因而对周围的pH值、盐类、离子浓度及温度等环境的变 化非常敏感[32-33]。
牛乳酸化过程中酪蛋白理化性质的变化： pH 5.8-5.5:Z-电位降低，酪蛋白胶束倾向于聚集[34-36];
pH5.5-5.0:酪蛋白胶束以一定的顺序发生溶解（尤，);酪蛋白胶束中的 胶体磷酸钙溶解[37]，使胶束的流体力学直径过渡性减少；
pH小于5:胶体磷酸钙完全溶解[38];胶体所带电荷随着pH值的降低而下降，酪蛋白胶 束间的静电排斥作用减弱；同时心酪蛋白也随着pH值的降低而塌陷，其空间位阻作用也 会降低[39]。由于两种作用的消失，胶束粒子易于聚集，使乳体系失稳。
1.3.4多糖稳定酸性乳饮料研究 1.3.4.1多糖与蛋白质之间的相互作用
酪蛋白之所以能稳定存在于牛乳中，一般认为是胶粒之间的静电排斥和空间位阻共同作
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用的结果[36]。在酸性条件下（低于酪蛋白等电点时），酪蛋白胶粒倾向于聚集使体系失稳[40]。 因此在酸性乳饮料的生产过程中，常常需要加入稳定剂以提高体系的稳定性。在酸性乳饮料 中添加的稳定剂多是多糖高分子。
蛋白质与多糖在水溶液中的交互作用主要有如图1-6所示的三种形式，即共容 (Cosolubility)、络合(complex coacervation)及不相容(Incompatability)[41]。共容是指多糖和蛋
白质的相互作用类似于相同聚合物间的相互作用而发生的实质性的混合。鉴于蛋白质与多糖 都是多聚体，实际能够形成共容的聚合物混合体系是很少见的。络合是指蛋白质与多糖可在 水溶液中发生交互作用，即大分子间相互吸引，通过静电相互作用、氢键或共价键进行连接， 形成络合物。而不相容即两种分子间以斥力为主，不发生相互作用，络合物的形成受到抑制。
图1-6多糖/蛋白质/水三元聚合物溶液的状态[56]
Figure 1-6 Classification of the mixing behaviour of ternary polymer solutions solvent +
polysaccharide + protein
对多糖和蛋白质共存的体系，多糖是否容易吸附在蛋白质上，多糖本身是否凝胶以及其 添加的浓度都对稳定效果有很大的影响。多糖在蛋白质胶体悬浮液中不同的作用状态见图 1-7、1-8、1-9 [42]。
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脅：.•為-bl梦參
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图1-7加入蛋白质胶体体系中的多糖不与蛋白质发生吸附，多糖自身不形成凝胶 Figure 1-7 Non-adsorbing, non-gelling polymer in colloidal dispersions.
图1-7中，对于非吸附、非凝胶多糖，随着多糖浓度的増加，系统发生如下变化[43]: (a) 稳定、（b)耗散絮凝（depletion flocculation )、（c)稳定。在多糖浓度低的情况下，体系 是稳定的。随多糖浓度升高，发生耗散絮凝，体系分为两相，一相为富含多糖的水溶液，另 一相为酪蛋白的聚集体。这种不稳定的状态经过一段时间后可能形成假稳定状态（b*)--重 组紧密堆积的胶粒网络结构。当多糖浓度继续升高，体系因粘度増加而稳定，但高浓度在实 际体系中是不适用的。
图1-8中，对于吸附、非凝胶多糖，随着多糖浓度的増加，系统发生如下变化：（a)架 桥絮凝（bridge flocculation)、（b)稳定、（c)耗散絮凝（depletion flocculation)。在多
糖浓度低的情况下，多糖分子同时与几个酪蛋白胶粒作用，发生架桥絮凝，使酪蛋白聚集， 体系失稳。如体系里存在过多的未发生吸附的多糖，会引起耗散絮凝，多糖从酪蛋白胶粒之 间排挤出来，导致周围和胶粒之间的多糖存在浓度差，在渗透压的作用下，使胶粒发生聚集
[41]
图1-8加入蛋白质胶体体系中的多糖能与蛋白质发生吸附，多糖自身不形成凝胶
Figure 1-8 Adsorbing， non-gelling polymer in colloidal dispersions.
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图1-9中，（a)非吸附、凝胶多糖在酪蛋白胶粒周围产生网络结构；（b)吸附、凝胶 多糖将胶粒包裹在凝胶结构里，这两种情况都很稳定。（c)对吸附、凝胶多糖来说，如果多 糖的浓度低于形成凝胶的临界浓度，则发生架桥絮凝使体系失稳[44]。
图1-9加入蛋白质胶体体系中的多糖能够形成凝胶 Figure 1-9 Gelling polymer in colloidal dispersions.
多糖高分子之所以能稳定酸性乳饮料有三个方面的原因：首先，多糖高分子添加到酸性 乳体系中可以増加体系粘度，减少分散粒子的碰撞和聚集；其次，多糖高分子能够吸附在酪 蛋白的表面，形成“毛发结构”或者“聚电解质刷结构”，提供静电排斥作用和空间位阻作 用；再次，多余的多糖高分子可以在酸性乳体系中相互交联，缠结形成网络结构，避免分散 粒子的相互接触[41]。
1.3.4.2常用多糖稳定剂简介
现在对多糖稳定剂研究较多的是果胶，可溶性大豆多糖，海藻酸丙二醇酯等。他们都是 阴离子多糖，被认为是目前稳定效果较好的多糖稳定剂。
一、果胶
果胶是从苹果果渣、柑橘皮及甜菜块茎等植物的细胞壁提取出来的多糖，果胶类多糖通 常为杂多糖，其包括三大类：半乳糖酸酸聚糖（homogalacturonans HGA)、鼠李半乳糖酸酸 聚糖 I (Rhamnogalacturonans RG I )和鼠李半乳糖酸酸聚糖 II (Rhamnogalacturonans RG
II)。HGA是由a -D-半乳糖醛酸残基通过1，4糖苷键连接而成的线性聚糖，由100〜500个 GalA残基组成。若在a -(1—4)连接的多聚半乳糖醛酸主链中间插入一些吡喃型鼠李糖(Rhap) 即为鼠李半乳糖醛酸聚糖I。它由半乳糖醛酸和鼠李糖交替组成的重复单位：4)-a -D-GalpA-(1，2)-a -L-Rhap-(1。在鼠李糖残基的G4位结合有不同种类的中性或酸性寡聚糖： 阿拉伯半乳聚糖（ara-binogalactans)以P -(1—4)连接的多聚半乳糖为主链并带有a -(1—5)L-
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阿拉伯呋喃糖残基(Araf)侧链。RG2II的结构与RG2 I完全不同。因为它的主链并非在4- a -D-GalpA-(l，2)-a-L2Rhap-l 毛发区，而是 1，4-a-D-GalpA 光滑区，主链上的 GalpA 至
〇Gal
LM6
RG-I
HGA
RG-II
methyl-ea
acelyl-«8t
stenfication of HG backbone?
ienfcaton of HG backbone7
datnbution m pectin chains
cMorM of xylose substitution
Xylogalacturonan
degree and pattern of scetyl-estenfcaton
degree and pattern of methyl-«sJenficati〇n
distribution of »ide chains in RG backbone
linkages and branching of side chams
lencth of side chains
nature of sugars in side chains
■ degree GalAr
and pattern of methyl-esterfication of
residues
length of xylose side chains
distnbuOon of sjbstituents over backbone
少为8个，己确认四种支链结构。两种双糖残基侧链结合于GalpA的G3位，另外两种寡糖 残基侧链结合于GA的G2位。RG2II为低分子量(5210Kd)果胶类多糖，包含11中不同的糖 残基，因而结构更为复杂。其结构如图1-10所示[45]。
GalA residues
Apiogalacturo
degree of apiose subsl
nan
：Kution
degree and pattern of meihyt^sterification
length of apiose side chains aismbubon of sjbstrtuents over ba degree and pattern of methyl-este
图1-10果胶结构示意图 Figure 1-10 Schematic diagram of pectin
凝胶化作用是果胶的一大特点。在一定条件下，果胶分子间可以交联成一种网状结构， 水和可溶性固体被封入其网络之中，从而完成凝胶化。果胶的化学构造、温度、pH值、钙 离子、糖等因素，影响着果胶的凝胶作用与凝胶强度。其中半乳糖醛酸的羧基有不同程度的 甲酯化，根据酯化度的不同，果胶有高酯果胶（HM)与低酯果胶(LM)之分。甲酯化程度是影 响果胶流变学性质和其他性质的重要因素，同时也决定了果胶的应用途径。増黏与稳定化作 用是果胶重要的食品学性质。其中作为酸性乳饮料的稳定剂是果胶在食品工业中的主要用途 之一。
在中性条件下，酪蛋白表面的K酪蛋白伸出酪蛋白表面，可以提供静电排斥作用和空间 位阻作用，这是酪蛋白在中性条件下稳定的原因。当加入果胶后，随着pH值的降低，由于 果胶与酪蛋白间的静电作用，果胶会吸附在酪蛋白胶粒表面，提供K酪蛋白之前提供的静电 排斥作用和空间位阻作用从而稳定酪蛋白@]。其作用机理如图1-11所示。
Parker[47]等通过实验证明酪蛋白/果胶复合物的zeta电位很小，其静电排斥作用不足以
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提供复合胶粒间的稳定性，据此推测吸附在酪蛋白胶束上的果胶所提供的静电排斥作用不是 酪蛋白在酸性条件下稳定的主要原因，而其提供的空间位阻作用是主要原因。即在低pH值 下，吸附于酪蛋白胶束表面的果胶分子链向外伸展，相当于在中性条件下酪蛋白表面的K- 酪蛋白的‘‘毛发结构”或者‘‘聚电解质刷结构”（如图1-12所示)。Tmmer等[25]利用动态光 散射方法研究了果胶在酪蛋白胶束上的吸附及吸附层的厚度。结果表明，当酪蛋白/果胶复 合体系的pH值小于5时，由于果胶与酪蛋白间的静电作用，果胶在酪蛋白胶束上发生了多 层吸附。
Figure 1- 11 Schematic picture of the ^replacement5 of K-casein by pectin on lowering pH， and casein micelles „coated’with adsorbed pectin molecules.
Tromp等[48]研究了非吸附果胶在酸性乳体系中的存在状态。他们发现在他们的研究体系 中，添加果胶中的90%都不与酪蛋白发生吸附，而是存在于酸性乳体系中，非吸附果胶之 间可以形成弱网络结构，从而増加酸性乳饮料的稳定性。可是当把非吸附果胶从酸性乳体系 中分离出来时，并不会导致酸性乳体系的不稳定。所以，非吸附果胶可以形成弱网络结构増 加酸性乳饮料的稳定性，但不是稳定酪蛋白的最主要因素。
所以，目前对果胶稳定酸性乳饮料机理的共识是：（1)在酸性条件下，果胶吸附在酪 蛋白表面提供一定的静电排斥作用和空间位阻作用使酪蛋白胶粒体系稳定；（2)对于酸性乳 体系中的非吸附果胶，他们之间或与吸附有果胶的酪蛋白粒子形成凝胶网络结构，从而也起 到一定的稳定作用。其稳定机理如图1-12所示。
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图1-12酸性乳饮料中非吸附果胶与带有果胶吸附层的乳蛋白形成弱复合网络的示意图 Figure 1-12 Schematic drawing of the distribution of protein gel particles (round) and pectin (randomly winding lines) in acidified milk drinks of pH 4. There are voids filled with serum pectin among clusters of pectin-coated protein particles.
二、可溶性大豆多糖
可溶性大豆多糖(Soluble Soybean Polvsaccharides, SSPS)是一种来源于大豆的水溶性多
糖类，属酸性多糖，最早在1993年由日本不二制油公司开始商业化生产。可溶性大豆多糖 结构类似果胶，由半乳糖(Ga1)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖醛酸(GalA)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖 (Fue)、木糖(Xy1)和葡萄糖(G1e)等组成[49]。其主要的构造是聚鼠李糖半乳糖醛酸和聚半乳糖 醛酸的主链上结合着半乳聚糖和阿拉伯糖聚糖，侧链近似球状结构；另外还有一些蛋白质成 分结合在糖链上，相对分子质量约为30〜100万。
可溶性大豆多糖的结构使其在水溶液中具有相对较低的粘度和较高的稳定性;优良的溶 解性能，无论在较高的温度或是较低的温度下都可以溶解，且溶解冷却后不会形成絮凝和凝 胶现象；溶液的粘度受酸、热及盐的影响很小。
可溶性大豆多糖的这些优良特性使其具有很多独特的功能，如酸性条件下对蛋白颗粒的 稳定作用、乳化和乳化稳定性、抗粘结性、发泡稳定性及成膜性能等，作为稳定剂、乳化剂、 抗结剂和分散剂等广泛应用于各个领域，且可溶性大豆多糖本身即是膳食纤维，因此可适于 添加到各种食品中。1994年开始被应用到酸性乳体系中作为稳定剂。可溶性大豆多糖溶液 的粘度低于果胶，用于稳定酸性乳饮料时具有更清爽的口感，并且其用量少于果胶时就可以
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达到相同的稳定效果。
Nakamura等[50]用酶解法对比研究了可溶性大豆多糖和果胶对酸性乳体系的稳定作用。 当酶解掉可溶性大豆多糖的阿拉伯多糖(Arabinan)或半乳聚糖(galactan)的中性支链后，其稳 定作用消失，而酶解开主链的半乳聚糖或鼠李二半乳糖酸酸聚糖(rhamnog-alacturonan)时，
其对酸性乳体系仍有较好的稳定效果。相反的是，当果胶主链被酶解后其稳定作用明显减弱， 而中性支链被酶解后稳定效果没有显著变化。根据以上实验结果，Nakamura认为可溶性大 豆多糖和果胶稳定酸性乳系的机理不同。由阿拉伯多糖或半乳聚糖构成的中性支链多糖是可 溶性大豆多糖稳定酸性乳体系的关键因素。当可溶性大豆多糖吸附到酪蛋白表面后，较长的 中性支链提供很好的空间稳定作用以稳定酸性乳体系。而果胶相对于可溶性大豆多糖来说， 主要是由于吸附有果胶的酪蛋白复合胶粒间的静电排斥作用。这一实验结果与前述的结论是 不一致的，对于果胶稳定酸性乳体系的机理还有待于进一步的探讨。
Nakamura等[51]还对可溶性大豆多糖和果胶对酸性乳体系稳定作用的差异进行了对比研 究。果胶所带的电荷较多，在果胶/酪蛋白复合体系刚开始酸化时，在pH为5.8〜5.0的范 围内，就可以吸附到酪蛋白胶束上，某种程度上影响了酪蛋白胶束的重排。而可溶性大豆多 糖在pH大于4.6时，不能与酪蛋白发生相互作用，当体系pH小于4.2时，可溶性大豆多糖 的稳定效果要优于果胶。这些差别是由于两者分子结构的不同，可溶性大豆多糖带有少量的 电荷和较长的中性支链，与酪蛋白发生吸附后，其中性支链会提供较强的相互作用。
蛋白质分子是由含有酸性羧基和碱性氨基的肽链组成。当蛋白质溶液中加入可溶性大豆 多糖时，可溶性大豆多糖的酸性主链与蛋白质的碱性氨基结合，使整个结合体带负电荷而相 互排斥，防止蛋白粒子因相互接触而沉淀，与其它酸性多糖稳定剂相比，大豆多糖还有较长 的中性支链，能维持蛋白粒子更大的空间结构，使蛋白颗粒即使在等电点也不能相互接触而 沉淀，这就是大豆多糖优于其它稳定剂并在酸性条件下稳定蛋白的原因。
三、海藻酸丙二醇酯
海藻胶是英国化学家E.C.C.Stanford在l880年首先发现的[52]。约50年后Kelco公司开 始将海藻酸盐作为商品大量生产，并于1934年采用乳溶性海藻胶首次作为冰淇淋的稳定剂 使用。1949年，又研究出海藻酸的有机衍生物一海藻酸丙二醇酯(简称PGA)。PGA由天然 海藻中提取的海藻酸经深加工制成，外观为白色或淡黄色粉末，水溶液呈粘稠状胶体，粘度 高，透明度大。海藻胶或海藻酸盐主要由两种单体(甘露糖醛酸和古洛糖醛酸)或三种不同的 结构链段(-M-M-M-M-，-G-G-G-G-和-M-G-M-G-)所组成，单体和链段各不相同。海藻酸的 单体取决于海藻胶原料，所以每一种海藻均会含有不同结构的海藻胶。它的特殊结构也对其
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性质有很大的影响，尤其是对有钙离子存在时的胶凝作用。海藻胶可以作为食品添加剂用于 食品工业中是由于它具有独特的胶体特性如稳定性、増稠性、乳化性、成膜性、悬浮性以及 能形成凝胶的能力。而其衍生物PGA与海藻酸相比，有很多优势。由于海藻酸的一部分羧 基被丙二醇酯化，一部分被适当的碱中和，所以PGA可以溶于水形成粘稠胶体，并能溶于 有机酸溶液。PGA在pH为3〜4的酸性溶液中能形成凝胶，但不会产生沉淀，其抗盐性强， 即使在浓电解质溶液中也不盐析，因此PGA能改善酸在食品中的稳定性，也能阻止在食品 饮料中因钙和其他高价金属离子所引起的沉淀作用。
在一定条件下，蛋白质可以与PGA反应，但由于PGA分子中反应活性点较少，所以其 反应活性比未酯化的海藻酸盐弱。在弱碱条件下，PGA也可以与蛋白质或其他聚合物分子 如淀粉进行交联反应。当体系pH升到8〜9并保持较低温度时，可以观察到其流变性质的 变化，如粘度増大。在40-50°C下，PGA可以与明胶反应，能得到快速凝固的凝胶，这种凝 胶在沸点下是热不可逆的。
PGA除具有胶体性质外，其分子中还含有丙二醇基，所以其亲油性强，乳化稳定性好。 因此，PGA更能有效应用于酸性乳饮料、果汁饮料等低pH值的食品和饮料中。PGA溶液 的亲脂性使其可有效地用作饮料、糖浆、奶油、色拉油及啤酒的稳定剂。当利用PGA的亲 脂性时，应选用高酯化度的PGA。因为酯化度越高，PGA溶液的亲脂性与表面活性越强。 此外，要尽量使用低粘度的PGA。
目前国内食品工业中对PGA的应用还不是很广泛，但近年来我国的低pH范围的饮料 和食品发展非常迅速，而PGA很适合在它们中应用。可以预计在今后一段时期内，PGA在 我国食品工业中的应用比例将会明显提高。
1.4本文使用多糖简介
一、羧甲基纤维素钠
羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC),是由D-卩比喃葡萄糖通过
P-(1—4)-糖苷键链接而成的阴离子型线性高分子，是纤维素的羧甲基化衍生物，也是最主要 的离子型纤维素胶。CMC于1918年由德国首先制得，并于1921年获得专利而见诸于世， 此后便在欧洲实现商业化生产。1947年，美国FDA根据毒物学研究证明：CMC对生理无 毒害作用，允许将其用于食品加工业中作添加剂。
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CMC为阴离子型线性高分子，结构如图1-13。羧甲基可以在葡萄糖单元的2、3、6位 上发生取代，所以CMC往往有不同取代度。CMC的实际取代度一般在0.4-1.5之间，食品 用CMC的取代度一般在0.6-0.95,近年来修改后的欧洲立法允许将取代度最大为1.5的CMC 用于食品中[53]。聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,CMC因具有许多特殊性质，如増稠、乳化、粘结、持水、成膜、悬浮等，
R=H 或 CH2COOH 图1-13羧甲基纤维素钠的结构（CMC)
Figure 1-13 Structure of caboxymethylcellulose(CMC)
在食品行业有广泛应用。国内常将CMC用作酸性乳饮料的稳定剂，因此，对CMC与酪蛋 白之间的相互作用以及CMC对酸性乳饮料的稳定效果的研究一直备受关注。
二、羧甲基可德胶
可德胶(Curdlan)是由粪产碱杆菌(Alcalige faecalis)发酵而产生的微生物多糖[54]。可德胶 首先在1964年被原田笃也教授发现，1989年日本武田公司才开始商业生产可德胶。1996 年可德胶获美国食品和药物管理局(FDA)认证，可在食品中用作添加剂[55]。可德胶无支链， 是一种全部由P-(1-3)糖苷键连接而成的D-葡聚糖多糖，其分子式为(C6HWO5)n，天然可德 胶分子量一般在数万至上百万之间。固体可德胶为白色粉末，无毒，不溶于水，可溶于碱溶 液和DMSO水溶液。可德胶凝胶性质独特，与其它多糖凝胶性质完全不同，根据加热温度 的高低，其水悬浮液既能形成热可逆凝胶，也能形成热不可逆凝胶。
可德胶不溶于水，这限制了它的应用。但可德胶分子中存在大量羟基，所以可以通过化 学改性引入不同的基团而増强其溶解性。羧甲基化改性是多糖常用的化学改性方法，可以应 用于可德胶。经羧甲基化改性后的可德胶，溶解性及生物活性明显提高。羧甲基可德胶因具 有独特的理化性质使之在食品中具有潜在的应用价值。
三、玉米纤维胶
玉米纤维胶是通过过氧化氢的碱性溶液从玉米纤维中提取得到的。玉米纤维是一种来源 非常丰富并且价格低廉的玉米仁湿磨副产物，玉米纤维包括玉米仁的果皮层和胚乳细胞壁等 纤维性部分。商业化的玉米干磨加工也是玉米纤维的来源之一。研究发现[56]玉米纤维胶具 有高度支化的结构，p-(1-4)-吡喃木糖作为主链，a-L-阿拉伯呋喃糖作为侧链，另外还有一些
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D-葡萄糖醛酸连接在主链木糖的O-2位置，还有一些半乳糖和木糖连接于作为侧链的阿拉 伯呋喃糖上。玉米纤维胶具有水溶性好，溶液粘度低的特点，是食品行业潜在的乳化剂[57]
1.5本课题的研究内容
酸性乳饮料(acidified milk drink,简称AMD)是一种以鲜奶、复原奶和豆奶为主要原料， 添加其他甜味剂、稳定剂、香精和色素等辅助原料，利用活性菌进行乳酸发酵或者直接添加 果汁、食品酸（乳酸、苹果酸和柠檬酸等）辅助原料调配获得的pH介于3.8到4.2 (低于酪 蛋白的等电点4.6)，蛋白含量大于1%的含乳饮料。酸性乳饮料因其美味的口感和独特的性 能而备受消费者欢迎，但脂肪上浮和蛋白质沉淀却一直制约着酸性乳饮料产品的生产和开 发，因此在酸性乳饮料生产过程中往往需要添加稳定剂。虽然研究者对多糖稳定剂与酪蛋白 的相互作用研究较多，但多集中在果胶、明胶、可溶性大豆多糖、海藻酸丙二醇酯等多糖高 分子，对羧甲基纤维素、羧甲基可德胶等在酸性乳饮料的研究较少。另外对于多糖与蛋白质 的相互作用的研究也多采用脱脂酸性乳体系，对全脂酸性乳体系涉及也很少。本文采用全脂 酸性乳体系作为研究对象，研究了三种多糖对其的稳定效果、其自身因素对稳定效果的影响、 并对其稳定机理进行了探究。本论文具体研究内容包括：
(1)羧甲基纤维素钠对酸性乳饮料体系的稳定效果，其添加量、分子量与取代度对其 稳定酸性乳饮料的影响，稳定机理以及脱脂乳体系和全脂乳体系的对比；
(2)羧甲基可德胶的合成、表征，羧甲基可德胶对酸性乳饮料的稳定效果，羧甲基可 德胶的添加量、分子量对稳定效果的影响，羧甲基纤维素钠、羧甲基可德胶稳定酸性乳饮料 对比；
(3)玉米纤维胶的表征及其对酸性乳饮料的稳定效果。
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第二章羧甲基纤维素钠稳定全脂酸性乳饮料研究
2.1引言
酸性乳饮料（acidified milk drinks, AMD)是以鲜奶、复原奶或豆奶为主要原料，添加 甜味剂、稳定剂、香精和色素等辅助原料，利用活性菌进行乳酸发酵或直接添加果汁、食品 酸等（乳酸、苹果酸和柠檬酸等）调配而制得的pH介于3.8到4.2之间，蛋白含量大于1% 的含乳饮料[58]。在酸性条件下（低于酪蛋白等电点时），酪蛋白胶粒倾向于聚集而使体系失 稳。因此在酸性乳饮料的生产过程中，需要加入稳定剂以提高体系的稳定性。
羧甲基纤维素钠（CMC)可作为酸性乳饮料的稳定剂。CMC的添加量、分子量、取代 度等都会对CMC与酪蛋白的相互作用以及CMC对AMD的稳定效果产生影响。本章将讨 论这些参数对CMC与酪蛋白的相互作用以及CMC对AMD的稳定效果的影响，并对CMC 稳定脱脂酸性乳体系和全脂酸性乳体系进行了对比。
2.2材料与方法
2.2.1实验试剂
表2-1 CMC的样品信息 Table 2-1. Information for different CMC samples.
样品来源简称分子量取代度（DS)
CMC⑴250,0000.7
美国Acros公司CMC(II)250,0000.9
CMC(III)250.0001.2
CMC(IV)700,0000.9
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表2-2模拟牛乳渗析液(SMUF)的配比 Table 2-2 The formulation of SMUF (simulated milk ultafiltration)
样品名称重量/ g样品名称重量 / g
磷酸二氢钾1.58氯化钙1.0
柠檬酸钾1.2氯化镁0.65
柠檬酸钠1.79碳酸钾0.3
硫酸钾0.18氯化钾0.6
柠檬酸及表2-2中试剂:分析纯，中国国药（集团）上海试剂公司；
全脂奶粉新西兰恒天然合作集团；
叠氮化钠上海科旺化学试剂有限公司。
2.2.2实验仪器
高压均质机上海东华高压均质机厂；
85-1磁力搅拌器上海克威电器有限公司；
PHS-3TC 数显 pH i十上海天达仪器有限公司；
高速冷冻离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司；
动态光散射仪马尔文仪器有限公司；
AR-G2旋转流变仪TA Instruments,美国；
稳定度分析仪LUMIFuge德国L.U.M. GmbH公司。
2.3实验方法
2.3.1样品制备
在2L的烧杯中加入1L的超纯水，按表2-2所示的样品比例依次加入样品，待之前加 入的样品溶解以后再加入下一个样品。搅拌，使充分溶解。将配好的模拟牛乳渗析液 (SMUF)[59]放在4°C的冰箱内放置。
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用全脂奶粉和超纯水配制成8%的复原乳，在4°C的冰箱内放置隔夜，使其充分水合。 将CMC配制成0.5%的溶液，在4°C的冰箱内放置隔夜，使其充分水合。以1:100的比例将 复原乳稀释在模拟牛乳渗析液中，作为参比。在参比体系中加入不同比例的CMC溶液配成 一系列样品。
2.3.2CMC的流变学测试
稳态剪切粘度及动态粘弹性实验在AR-G2旋转流变仪上进行，夹具选用角度为2° ' 8〃、直径为60 mm的锥板，锥板与平板间的间距为58叫。实验温度由循环水浴及帕尔贴 (peltier)系统控制在25 C,精度为±0.1 C。稳态剪切速率范围0.01〜1000 s-1。动态频 率扫描范围0.01〜100 rad/s，测试均在样品的线性粘弹区内进行。为了避免实验过程中溶液 溶剂的挥发，采用一薄层轻质硅油（聚二甲基硅氧烷，25 C时粘度为10 mPas)覆盖其暴 露表面。
2.3.3粒径及zeta电位的测定
用动态光散射粒径分析仪(DLS, Zetasizer Nano ZS90 , Malvern)测量在调酸过程中，粒子
粒径的变化。粒径仪所用的光源为最大输出功率10W的He-Ne激光，检测波长为633nm。 盛有样品的一次性聚苯乙烯样品池在Joule-Peltier恒温器上恒温至测量温度25C。在样品中 滴加柠檬酸，跟踪酪蛋白的粒径随体系pH值的变化以及CMC在酪蛋白上的吸附层厚度。
在上述参比体系及一系列含有不同浓度的CMC样品中，滴加柠檬酸，蛋白质胶体粒子 的电位随pH值的变化用Malvern的Nano-ZS90 Zetasizer ZEN3690型分析仪测定，温度 为 25°C。
2.3.4全脂酸性乳饮料的制备
分别在45C下配制8%的全脂奶粉、75C下配置0.8%的CMC水溶液，当溶液冷却至 室温时，向全脂奶粉中加入不同含量、不同分子量和不同取代度的CMC溶液，混合搅拌， 再将混合后的溶液温度降至20C以下，用柠檬酸将pH值调到4.00,再在200bar下均质， 最后加入0.05%的叠氮化钠，储藏一夜后准备测试。
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2.3.5沉降量测试
称量离心机专用试管的重量W1，在试管中加入10g酸性乳饮料样品，放入离心机中在 5000r/min下离心20min，将试管中样品倒出，试管倒立5min后称其重量为W2，沉降量用 下式计算：
沉降量=(W2-W1) /10X100%
每个样品进行三次平行实验，取其平均值。
2.3.6稳定性测试
稳定性分析仪LUMIFuge的特点是能通过离心来増加分离速度从而减少测试时间，它 是通过测定发射光的透过率来分析样品的粒子分布情况和稳定性。在测试过程中，集成的光 电传感系统不仅可以检测到透过率随时间的变化，还能检测整个样品池的透过率的变化，通 过分析这些数据得到样品随时间和空间变化的分离过程[60]。如图2-1所示[61]，在6-2300个 重力加速度的离心力的作用下，粒子的迁移速度加快，从而引起局部粒子浓度的变化。局部 粒子浓度的变化会引起发射光透过率的变化。同时，粒子浓度和光的透过率也会随着时间的 推移而变化，透过率曲线也会随着时间变化由红色逐渐变为绿色。由此，LUMIFuge可以跟 踪体系粒子随时间和空间的迁移情况，从而得出体系的稳定情况。
图2-1 LUMIFuge的测试原理图 Figure 2-1 Conformation of LUMIFuge.
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图2-2不同样品的LUMIFuge测试结果 Figure 2-2 Results of different kinds of samples by LUMIFuge.
图2-2显示了不同样品的测试结果：沉降过程与上浮过程。对于乳体系而言，在贮藏过 程中出现的不稳定现象，如絮凝或凝聚，可在产品贮藏初期通过LUMIFuge进行动态分 析。一方面，LUMIFuge的精确度远高于肉眼观测，并可作出样品的沉降速率曲线；而另 一方面，它能方便地比较较稳定体系的相对稳定性[62]。
将上述制备的一系列全脂酸性乳饮料按照不同浓度、不同分子量、不同取代度分为三组， 分别取每组中的样品放入样品池中进行测试。仪器离心速率为3000 r/min，测试时间间隔为 1 min，测试4小时。
2.4结果与分析
2.4.1CMC溶液的流变学性质
CMC溶液的流变学性质依赖于其浓度[63-64]，图2-3给出了分子量为7X105、取代度为 0.9的CMC(IV)在不同浓度下的流变曲线。如图2-3所示，CMC溶液呈现显著的剪切变稀行 为，聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,其粘度随剪切速率变大而降低，表现出非牛顿性流体的性质，此范围被称为非牛顿区或 幂律范围。CMC溶液粘度对浓度有很强的依赖性，浓度的升高使链段密度増加，分子量之 间的相互作用増强，使CMC溶液的剪切粘度升高。即使在高剪切速率区，不同浓度的CMC 溶液的粘度仍可区别开。
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-ed / 厂
— m
0.4 wt% 0.5 wt% 0.6 wt% 0.8 wt%
1.0wt% 1.5 wt%
2.0wt%
丨10
图2-3 CMC (IV)在不同浓度下的流变曲线（T=22°C)
Figure 2-3 Viscosity as a function of the shear rate for CMC (IV) for various concentrations
in aqueous solution (T=22〇C)
-ed /v
0.01 0.1 1 10 Frequency / Hz
-■-2.0% G_
2.0% G"
一米一20%
1.5% G_ -〇- 1.5% G__
一米一15%
-A- 1.0% G_ -A- 1.0% G__
一米一1.00%
U.Kasner等[65]将CMC在溶液中的构象分为四种状态，对应于四个临界浓度。在低浓 度时，分子链间因静电作用呈伸展状态。C=C〇时，分子间的距离等于分子链的持续长度； C=Ci时，伸展的分子链开始发生交迭；C=C2时，卷曲的分子链开始发生交迭，浓度达到 C2后，聚电解质行为类似于不带电荷的高分子；C=C3时，分子链缠结开始形成凝胶。临界 浓度的确定受分子量影响很大。本实验中所用CMC浓度在C2〜C3之间，溶液具有粘弹性。
图2-4 CMC (V)在不同浓度下的动态测试结果（y=10%，T=25°C)
Figure 2-4 Storage modulus and loss modulus as functions of the frequency for CMC (V) in aqueous solution at different concentrations (y=10%,T=25C)
图2-4为不同浓度的CMC (V)的动态测试结果。如图所示，溶液的复粘度随浓度的 增加而升高。储能模量G’与损耗模量G’’均表现出频率依赖性，当CMC的浓度升高时，链
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段密度増加，松驰也变得困难，储能模量G’与损耗模量G"的交点向低频移动。此外，由于 链段密度升高，缠结点増多，使得模量上升，因此储能模量G’和损耗模量G”的交点也升高。
2.4.2CMC的添加量对酸性乳饮料稳定性的影响
2.4.2.1CMC的添加量对酸化过程中粒子粒径的影响
将具有相同分子量和相同取代度的CMC(lV)(Mw=250000，DS=0.9)加入到酸性乳 体系中，配置成具有不同CMC (IV)浓度的全脂酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比 例稀释在牛乳渗析液中，用动态光散射粒径分析仪(DLS, Zetasizer Nano ZS90 , Malvem)测量
在调酸过程中，粒子粒径的变化。结果如图2-5所示，全脂乳体系在酸化过程中，随着pH 值的降低，在pH 5.8-5.2之间，所测粒子粒径减小。这是因为酪蛋白胶束中有部分a-酪蛋白 和P-酪蛋白的溶出，使得酪蛋白胶束的结构发生塌陷，导致粒径值减小[25]。在pH降低到 4.7,接近酪蛋白的等电点时，粒子粒径值发生突増，超过1^m;用肉眼可以观察到明显的 聚集现象，体系失稳。
图2-5加入不同浓度CMC (V)的全脂乳体系酸化过程中粒子粒径变化图 Figure 2-5 Changes of the particle size and zeta potential during the acidification process of whole milk systems with different concentrations of CMC (V)
当加入CMC (V)时，在相同的pH范围内(pH 5.8-5.2)，粒子的粒径减小，这是由于 CMC的存在并不影响a-和p-酪蛋白的溶出[27]。当pH降低到5.2左右时，粒子粒径开始増 大。此时，CMC与酪蛋白胶束发生静电作用，吸附于粒子表面[66]。pH降低，在5.2-4.0之
27
间，酪蛋白胶束中K-酪蛋白的塌陷速率和CMC往胶束上的吸附速率基本平衡，粒径变化不 大。pH继续降低，当加入的CMC浓度不足时，不能和胶束发生饱和吸附，胶束间的空间 位阻效应减弱，体系失稳，粒径突然増大[67]。随着CMC添加量的増加，更多的CMC吸附 到酪蛋白胶束上，所以所测的粒子的粒径也増加。当加入0.003%的CMC时，可以使体系 稳定到pH 3.9,当加入0.0045%的CMC时，可以使体系稳定到pH 3.7左右，当加入0.008% 和0.04%的CMC时，酪蛋白胶束在pH=3.0时也没有发生聚集。所以，加入的CMC的浓度 越大，酪蛋白胶束的稳定性也越好，0.008%的CMC足够可以稳定酪蛋白胶束。
2.4.2.2CMC的添加量对酸化过程中粒子zeta电位的影响
将具有相同分子量和相同取代度的CMC(lV)(Mw=250000，DS=0.9)加入到酸性乳 体系中，配置成具有不同浓度CMC的酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比例稀释在牛 乳渗析液中，用Malvem的Zetasizer Nano ZS90型分析仪测定在调酸过程中，粒子zeta电
G-5-10-15-20-25
i/ lelod-t
—□—whole milk
-0-0.003% CMC(Mw=250000,DS=0.9) -t^i-0.0045% CMC(Mw=250000,DS=0.9) -^-0.008% CMC(Mw=250CMX),DS=0.9) -<0-0.04% CMC(Mw=250000.DS=0.9)
位的变化。如图2-6所示，全脂乳体系中粒子的zeta电位一直随pH的降低而増加，这是由 于酪蛋白胶束表面负电荷逐渐被中和。在接近等电点时，胶束间静电排斥作用逐渐消失，同 时由于随着pH的降低，酪蛋白表面的K-酪蛋白发生塌陷，使得维持酪蛋白稳定的空间位阻 作用大幅度减小。提供酪蛋白胶束间斥力的主要是空间位阻作用，当其小于胶束间的范德华 吸引力时，酪蛋白发生聚集，造成体系失稳。另外，全脂乳体系在酸化过程中，胶束的zeta 电位并不随pH值的降低而单调变化，这可能与酪蛋白胶束在体系随pH值降低过程中，会 有部分磷酸钙及部分a -和P -酪蛋白的溶出有关，这一点同Schmidt的研究一致[68]。
图2-6加入不同浓度CMC的全脂乳体系酸化过程中粒子zeta电位变化图 Figure 2-6 Changes of the zeta potential during the acidification process of whole milk systems with different concentrations of CMC
28
当体系加入CMC时，由于带负电的CMC吸附到酪蛋白的表面[69]，酪蛋白的zeta电位 在5.2左右开始降低，与前面粒径増大所述的结果一致。随着pH降低，酪蛋白表面带的正 电荷越来越多，越来越多的带负电荷的CMC吸附到酪蛋白表面，使其zeta电位继续降低。 继续降低体系的pH,氢离子浓度的増加，会屏蔽CMC吸附层上的有效负电荷，使CMC分 子链卷曲，吸附层塌陷，zeta电位増加。相同pH下，加入的CMC浓度越高，体系的zeta 电位越低。总之，随着CMC添加量的増加，体系维持稳定的pH值趋于更低，粒子粒径愈 大，zeta电位愈负，这是由于更多的CMC吸附到胶束上，且所吸附的CMC大分子链能形 成loop状负电层，既提供了空间位阻，也提供了静电排斥的作用，因此体系得以稳定。
2.4.2.3 CMC的添加量对酸性乳体系沉降率的影响
图2-7 CMC的添加量对酸性乳饮料稳定性的影响 (1为0天，2为7天，3为30天，4为60天，5为160天；图片从左到右CMC的浓 度依次为 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%)
Figure 2-7 Effect of CMC5s concentration on the stability of acidified milk drinks.
(1, 0 day; 2, 7 days; 3, 30 days; 4, 60 days; 5, 160 days; CMC concetration in each picture from left to right: 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%)
配制含有不同含量CMC(IV)的酸性乳溶液，用柠檬酸将pH值调到4.00,在200bar下 均质，最后加入0.05%的叠氮化钠，放入100ml量筒中静止观察。图2-7显示了含不同含量 CMC的酸性乳体系随时间的变化情况。刚刚放置时，各体系均匀分布，是稳定均匀的体系。
29
静置7天后，不加CMC和加入0.1%CMC的酸性乳体系开始出现沉降，体系失稳。静置60 天后，CMC含量为0.2%的酸性乳体系也开始失稳。静置160天，CMC含量为0.3%，0.4%， 0.5%的酸性乳体系未见明显分层。
静置样品对于CMC浓度较低的样品，可以观察到样品分层进而比较其相对稳定性，而 对于CMC浓度较高的体系，静置往往不能观察到体系的沉降。为了更好地比较CMC添加 量对酸性乳体系沉降率的影响，我们采用离心分离的方法。称量离心机专用试管的重量W1， 在试管中加入10g酸性乳饮料样品，放入离心机中在5000r/min下离心20min，将试管中样 品倒出，试管倒立5mm后称其重量为W2,沉降量用下式计算：
沉降率=(W2-W1) /10X100%
每个样品进行三次平行实验，取其平均值。以CMC (IV)为稳定剂，以不同的添加量 用于全脂酸性乳饮料中，浓度在0-0.5%范围内，所测得的样品的沉降量列于表2-3中。当加 入的CMC浓度较低时，沉降率很大，随着CMC含量的増高，乳体系的沉降率也逐渐降低。 当CMC含量为0.2%时，与0.1%的体系相比变化很大；而当CMC含量提高到0.4%时，随 浓度的増加，沉降量没有太大改变，可以推测CMC在酪蛋白上的吸附存在一个临界吸附量， 当达到这个浓度后体系趋于稳定。沉降率的测定与静置观察的结果吻合。
表2-3 CMC添加量对酸性乳体系沉降率的影响 Table 2-3 Effect of CMC5s concentration on the sedimentation rate of acidified milk drinks
CMC添加量沉降率
No CMC (Mw=250000，DS=0.9)10.8%
0.1% CMC(Mw=250000，DS=0.9)9.6%
0.2% CMC(Mw=250000,DS=0.9)4.9%
0.3% CMC(Mw=250000,DS=0.9)4.7%
0.4% CMC(Mw=250000,DS=0.9)2.7%
0.5% CMC(Mw=250000,DS=0.9)2.6%
2.4.2.4 CMC的添加量对酸性乳体系LUMIFuge测定的影响
图2-8是含有不同浓度CMC (V)的全脂酸性乳体系的LUMIFuge分析结果，横坐标
尺度代表整个测试器皿，右端代表管底，横坐标越大越接近底部，纵坐标表示透过率，随着
30
时间的推移，测试线由红色变为绿色。当不加入CMC时，测试溶液的界面顶部和底部透过 率较低，中间较高。这说明样品很不稳定，样品池底部有蛋白沉淀，顶部有上浮的脂肪。加 入0.1%的CMC，样品测试结果和全脂乳饮料的相似，对样品的稳定性影响不大。当加入 0.2%的CMC时，测试结果清晰显示了样品的蛋白沉淀和脂肪上浮过程。CMC浓度继续増 大，加入0.3%CMC的体系测试过程中透过率变化不大，稳定性有很大的改善，当CMC浓 度増大到0.5%时，体系透过率几乎不变，稳定性很好。综上所述，加入CMC的浓度越大， 酸性乳饮料的稳定性越好，当浓度达到0.4%时，体系趋于稳定，与上面沉降量的结果吻合。
图2-8加入不同浓度CMC的全脂酸性乳体系的LUMIFuge分析图 (a、b、c、d、e、f 的 CMC 浓度分别为 0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%) Figure 2-8 LUMIFuge analysis diagram of acidified whole milk with different concentrations
of CMC
(a, b, c, d, e, f, CMC concentrations were 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%)
2.4.3CMC分子量、取代度对酸性乳体系稳定性的影响
2.4. 3.1 CMC的分子量、取代度对酸化过程中粒子粒径的影响
将具有不同分子量和不同取代度的CMC加入到酸性乳体系中，聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,配置成具有相同浓度、
31
不同分子量和不同取代度的CMC的酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比例稀释在牛乳 渗析液中，用动态光散射粒径分析仪(DLS, Zetasizer Nano ZS90 , Malvem)测量在调酸过程
中，粒子粒径的变化。测定结果如图2-9所示。相同取代度下（DS=0.9)，含高分子量CMC (Mw=700000)的稳定体系的粒子粒径较低分子量CMC (Mw=250000)的大。这可能是由 于高分子量的CMC具有更长的分子链，长链的CMC分子能够在酪蛋白胶束表面形成较大 的loop圈，从而使吸附层的厚度増大，造成粒径増大。相对分子量而言，CMC取代度的影 响较小。相同浓度、相同分子量下，取代度由0.7到1.2,粒子粒径逐渐减小，高取代度的 CMC对乳体系的稳定作用更明显。但在低pH值下，含高取代度CMC的稳定体系中粒子粒 径较小，这可能有两点原因：首先，分子量相同而取代度高的CMC所带的电荷较多，使 CMC与胶束的静电作用力较强，吸附层比较紧密；其次，取代度高，带有CMC吸附层的 胶束zeta电位较高，对要继续吸附的CMC有一定的排斥作用[70]，使CMC的吸附量减少。 两者的共同结果均使酪蛋白的粒径值减少。所以高分子量，高取代度的CMC的稳定效果更 好。
图2-9加入不同种类CMC的全脂乳体系酸化过程中的粒径变化图 Figure 2-9 Changes of the particle size during the acidification process of whole milk systems with different kinds of CMC
2.4.3.2CMC的分子量、取代度对酸化过程中粒子zeta电位的影响
将具有不同分子量和不同取代度的CMC加入到酸性乳体系中，配置成具有相同浓度、 不同分子量和不同取代度的CMC的酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比例稀释在牛乳
32
渗析液中，用Malvem的Zetasizer Nano ZS90型分析仪测定在调酸过程中，粒子zeta电位
的变化。测试结果图2-10显示含高分子量CMC的乳体系的粒子zeta电位更负，胶束的稳 定性更好。CMC的分子量越高，乳体系越稳定。相对分子量而言，CMC取代度的影响较小。 相同浓度、相同分子量下，取代度由0.7到1.2, zeta电位越来越负，胶束的稳定性更好。 综上所述，高分子量，高取代度的CMC的稳定效果更好，与粒径测试结果吻合。
0-005 >ul/ Ifljucallod-'r'
图2-10加入不同种类CMC的全脂乳体系酸化过程中zeta电位变化图 Figure 2-10 Changes of the zeta potential during the acidification process of whole milk systems with different kinds of CMC
2.4.3.3CMC的分子量、取代度对酸性乳体系沉降率的影响
在研究CMC的分子量、取代度对酸性乳体系沉降率的影响时，我们加入CMC的浓度 为0.4%，如果采用静置观察的方法，往往不能观察到明显的沉降现象，为了更好地比较CMC 添加量对酸性乳体系沉降率的影响，我们采用离心分离的方法。称量离心机专用试管的重量 W1，在试管中加入10g酸性乳饮料样品，放入离心机中在5000r/min下离心20min，将试管 中样品倒出，试管倒立5mm后称其重量为W2,沉降量用下式计算：
沉降率=(W2-W1) A0X100%。
每个样品进行三次平行实验，取其平均值。
选用具有不同分子量、不同取代度的CMC作为稳定剂，保持0.4%的CMC浓度，体系 沉降量如表2-4所示。比较CMC (II)和CMC (IV)发现：含有CMC (IV)的体系沉淀 率较低，稳定性较好，说明具有高分子量的CMC稳定效果更好。比较CMC (I)、CMC (II)、CMC (III)发现：CMC取代度越高，体系的沉降量就小，稳定性越好，表明将取 代度高的CMC用于全脂酸性乳中稳定性稍好。
33
表2-4 CMC分子量、取代度对酸性乳体系沉降率的影响 Table 2-4 Effect of CMC5s Molecular weight and degree of substitution on the sedimentation
rate of acidified milk drinks
0.4%CMC 样品沉降量
CMC (I) (Mw=250000, DS=0.7)2.8%
CMC (II) (Mw=250000, DS=0.9)2.7%
CMC (III) (Mw=250000, DS=1.2)2.0%
CMC (IV) (Mw=700000, DS=0.9)2.0%
2.4.3.4CMC的添加量对酸性乳体系LUMIFuge测定的影响
图2-11加入不同CMC的全脂酸性乳体系的LUMIFuge分析图 (a、CMC 1(Mw=250000.DS=0.7);b、CMC 2(Mw=250000.DS=0.9);c、CMC 3(Mw=250000.DS=1.2);d、CMC 4(Mw=700000.DS=0.9))
Figure 2-11 LUMIFuge analysis diagram of acidified whole milk with different kinds of
CMC
34
将加入不同CMC的全脂酸性乳体系进行LUMIFuge稳定性分析，测试结果如图2-11 所示。比较图2-11-a，2-11-b，2-11-c，CMC取代度为0.7时，在测试时间内，测试曲线由
红色向绿色变化明显，体系光透过率变化较大，体系存在沉降；当CMC取代度为0.9时， 体系透过率变化较小，体系较稳定；当CMC取代度为1.2时，体系光透过率几乎没有变化， 体系稳定。所以加入的CMC取代度越高，体系越稳定。图2-11-b与2-11-d的比较说明CMC 分子量越高，光透过率越低，体系稳定性越好。所以高分子量、高取代度的CMC的稳定效 果更好，与上面沉降量的规律吻合。
o o o o o
180604020 Eu/Ja®ui.2p aoccod
2.4.4全脂乳与脱脂乳在酸化过程中的比较
图2-12脱脂、全脂乳体系酸化过程中的粒径和zeta电位变化图（a为粒径变化，b为
zeta电位变化）
Figure 2-12 Changes of the particle size and zeta potential during the acidification process of whole milk systems and skim milk systems (a:change of particle size, b:change of zeta potential)
图2-12中比较了全脂、脱脂乳体系在调酸过程中的异同，由图可得全脂乳体系的粒子 粒径均比脱脂乳体系的粒径大，这正是由于全脂乳中脂肪的存在使测得的粒径变大。研究报 道，乳脂肪表面存在一层蛋白膜，易于蛋白发生融合[71]。Pereira[72_研究了全脂乳中脂肪 的存在状态，他们通过观察全脂乳的共聚焦显微镜图像发现，脂肪球包埋于蛋白胶束中，形 成新的包覆结构（cluster)，正是这个原因导致我们所测粒径増大。含有相同浓度CMC的 脱脂、全脂乳体系的粒径变化趋势基本一致，同时酪蛋白发生聚集的pH也相同。这说明脂 肪的存在并不影响酪蛋白在酸化过程中的溶出和塌陷，也不影响CMC与酪蛋白的相互作用。
加入不同含量CMC的全脂、脱脂乳体系在酸化过程中的粒子zeta电位变化趋势相同，
35
进一步说明脂肪的存在并不影响乳饮料酸化过程中酪蛋白的自身变化、也不影响CMC与酪 蛋白的相互作用。
2.5本章小结
(1)CMC溶液表现出显著的非牛顿流体性质，即稳态剪切粘度呈现显著的剪切变稀行 为；储能模量G’与损耗模量G”均表现出频率依赖性，当CMC的浓度升高时，链段密度増 加，松驰也变得困难，储能模量G'与损耗模量G"的交点向低频移动。
(2)CMC可以很好地稳定全脂酸性乳饮料，CMC可以在pH=5.2左右吸附在酪蛋白胶 束上，提供静电排斥效应和空间位阻效应，同时没有吸附在酪蛋白上的CMC还可以増加体 系粘度，从而能稳定酸性乳饮料。
(3)CMC的添加量是影响CMC稳定酸性乳饮料的关键因素，加入的CMC的浓度越 高，酸性乳体系的粒径越大、zeta电位越负、沉降率越低。所以CMC的添加量越多，其稳 定效果越好。
(4)CMC的分子量和取代度也是影响CMC稳定酸性乳饮料的重要因素，分子量与取 代度对稳定效果的影响虽不像浓度那样显著，但是高分子量、高取代度的CMC其对酸性乳 饮料的稳定效果好于低分子量、低取代度的CMC。
(5)CMC稳定脱脂酸性乳饮料与其稳定全脂酸性乳饮料相比，由于全脂酸性乳中存在乳 脂肪，其在调酸过程中，表面的脂肪蛋白膜组分类似于酪蛋白，因此埋藏于酪蛋白胶束内部， 导致全脂酸性乳体系中的粒径比脱脂酸性乳体系的粒径大。但是在酸化过程中，其粒径变化 和zeta电位的变化基本一致，说明脂肪的存在并不影响酪蛋白在酸化过程中的溶出和塌陷， 也不影响CMC与酪蛋白的相互作用。
36
第三章羧甲基可德胶稳定全脂酸性乳饮料研究
3.1引言
可德胶不溶于水，这限制了其在生物活性方面的应用，水不溶性通常认为是由于分子内 部以及分子间存在的大量氢键形成的结晶区域，与纤维素的情形相类似[73]。羧甲基化改性 是多糖常用的化学改性方法，被认为是另一种体现多糖功能性特性的途径[74-75]。对于可德胶 而言，羧甲基化改性的衍生物在能够带来很好的水溶性同时具有很好的生物活性，并且这一 结果己经取得了很好的实际应用：由于其本身具有的较强的免疫特性，国外己经将羧甲基化 改性的可德胶作为免疫化妆品中最重要的添加剂之一。它是一种生物反应修饰因子，能提高 人体自身的防御机制[76-77]。羧甲基可德胶的化学结构与羧甲基纤维素钠的化学结构非常相 似，前一章己经证明羧甲基纤维素钠可以很好的稳定酸性乳饮料，那羧甲基可德胶也可能是 一种潜在的稳定剂。
本章在前一章研究的基础上，合成和表征了羧甲基可德胶，探究了其在酸性乳饮料体系 中的应用，并将其稳定效果与羧甲基纤维素钠的稳定效果进行了对比。
3.2实验试剂与仪器
3.2.1实验试剂
日本武田-麒麟食品公司；
上海国药有限公司；
上海国药有限公司；
上海科旺化学试剂仪器有限公司; 新西兰恒天然合作集团；
上海化学试剂有限公司。
可德胶 氢氧化钠 异丙醇 氯乙酸 全脂奶粉 梓檬酸（分析纯）
37
85-1磁力搅拌器
3.2.2实验仪器
无锡市瑞江分析仪器有限公司;
上海天达仪器有限公司;
PHS-3TC 数显 pH i十
高速冷冻离心机
CQ-250超声仪
弘兴超声电子仪器有限公司;
动态光散射仪
马尔文仪器有限公司;
TA Instruments,美国
AR-G2旋转流变仪
上海克威电器有限公司;
红外测试仪
上海第二分析仪器厂;
DDS-11A型电导仪
Perkin Elmer 公司，美国;
Viscotek TDA305型体积排阻色谱联用光散射马尔文仪器有限公司。
3.3实验方法
3.3.1羧甲基可德胶的制备
室温下将3.0 g的可德胶悬浮于80 ml异丙醇中搅拌30 min,然后缓缓地加入(每隔10min 加1ml) 10g 30 wt%的氢氧化钠溶液（3g+7g水)，滴完后整个体系剧烈地搅拌90 min，升 温至55 °C。接着将3.6g氯乙酸溶于6ml异丙醇中，将混合液以10min的间隔分三次加入， 保持反应在55 °C下进行4 h。将最终得到的产物过滤，然后以乙醇、丙酮连续淋洗。最后 将沉淀物溶于蒸馏水中，用盐酸或乙酸调成中性。在4 C下用蒸馏水透析5天，再经过冷 冻干燥得到白色棉絮状的羧甲基化可德胶。
3.3.2羧甲基可德胶的红外表征和分子量测定
红外光谱实验在Paragon 1000型红外光谱仪（Perkin Elmer公司，美国）上进行，波长 范围为500 cm-1到4000 cm-1，样品采用KBr压片法制得。
羧甲基可德胶的分子量及分子量分布通过马尔文公司的Viscotek凝胶色谱系统来测
38
定，溶剂为0.05M NaN〇3，色谱柱流速为0.7 mL/分钟，柱温为30°C。
3.3.3羧甲基可德胶取代度的测定
称取0.2-0.3g的羧甲基可德胶放入250ml烧杯中，加入200ml去离子水，再加入3ml 0.5N 的NaOH溶液，搅拌1h—2h。用0.33N的盐酸溶液滴定，每次滴入0.3-0.4ml，充分搅拌后，
2 o
1L TA
XS.AIPnpuoo
图3-1羧曱基可德胶电导率滴定法 Figure 3-1 Conductometric titration of carboxymethyl curdlan
根据下面公式计算羧甲基可德胶的取代度[78]:
(V 2 - V1) N
Grams of samples
=Value A
(Ml. of NaOH x N) - (V1 x N) Grams of samples
Value B
A x 0.162
(1 + 0.022B - 0.08A)
DS
3.3.4羧甲基可德胶的超声分解
39
用上海第二分析仪器厂的DDS-11A型电导仪及铂黑电极测定测定溶液电导率，搅拌1分钟 后记录电导率值。当滴定到电导率发生明显増长后，停止滴定[78]。将电导率与加入的 盐酸体积作图，如图3-1所示。
用羧甲基可德胶配制1wt%的羧甲基可德胶水溶液，将溶液分成三份，用CQ-250超声 仪超声。在25°C、105Hz条件下，将样品分别超声1小时，2小时和3小时以得到不同分子 量的羧甲基可德胶。将超声后的羧甲基可德胶冷冻干燥，然后用Viscotek凝胶色谱系统测 定分子量及分子量分布。表征所用的Viscotek TDA305系统集成了 3种检测器，包括光散射 (7°小角光散射（LALS)和90。直角光散射（RALS))、折光指数仪（RI)和在线粘度检测 器（VIS)。色谱柱选用两根Viscotek A6000M色谱柱。流动相为0.05M NaN〇3，流速为0.7 ml/min，进样体积为100 W，温度为30C。利用OmniSEC软件进行数据的采集和分析。
3.3.5流变学实验
稳态剪切粘度及动态粘弹性实验在AR-G2旋转流变仪上进行，夹具选用角度为2° ' 8〃、直径为60 mm的锥板，锥板与平板间的间距为58叫。实验温度由循环水浴及帕尔贴 (peltier)系统控制在25 C，精度为±0.1 C。稳态剪切速率范围0.01〜1000 s-1。动态频 率扫描范围0.01〜100 rad/s，测试均在样品的线性粘弹区内进行。为了避免实验过程中溶液 溶剂的挥发，采用一薄层轻质硅油（聚二甲基硅氧烷，25 C时粘度为10 mPas)覆盖其暴 露表面。
3.3.6酸性乳样品制备
在2L的烧杯中加入1L的超纯水，按表2-2所示的样品比例依次加入样品，待之前加 入的样品溶解以后再加入下一个样品。搅拌，使充分溶解。将配好的模拟牛乳渗析液 (SMUF)[59]放在4C的冰箱内放置。
用全脂奶粉和超纯水配制成8%的复原乳，在4C的冰箱内放置隔夜，使其充分水合。 将CMC配制成0.5%的溶液，在4C的冰箱内放置隔夜，使其充分水合。以1:100的比例将 复原乳稀释在模拟牛乳渗析液中，作为参比。在参比体系中加入不同比例的CMC溶液配成 一系列样品。
3.3.7粒径及zeta电位的测定
用动态光散射粒径分析仪(DLS, Nano ZS90 Zetasizer ZEN3690, Malvern)测量在调酸过
40
程中，粒子粒径的变化。粒径仪所用的光源为最大输出功率10W的He-Ne激光，检测波长 为633nm。盛有样品的一次性聚苯乙烯样品池在Joule-Peltier恒温器上恒温至测量温度25°C。 在样品中滴加柠檬酸，跟踪酪蛋白的粒径随体系pH值的变化以及CMC在酪蛋白上的吸附
层厚度。
在上述参比体系及一系列含有不同浓度的CMC样品中，滴加柠檬酸，蛋白质胶体粒子 的电位随pH值的变化用Malvern的Nano-ZS90 Zetasizer ZEN3690型分析仪测定，温度 为 25〇C。
3.4结果与讨论
~'°/-90 匚n5l-Ew匚roJi
4000300020001000
Wavenumber (cm-1)
3.4.1羧甲基可德胶的红外表征
图3-2可德胶以及羧甲基可德胶的红外光谱谱图 Figure 3-2 FT-IR spectra of native Curdlan and carboxymethyl Curdlan
图3-2给出的是可德胶及其羧甲基化改性产物的红外谱图。由图中我们可以看出在3370 cm-1附近有一很宽的吸收峰对应于-OH的伸缩振动，比较两个谱图可以发现改性后该基团的 吸收峰明显向高波方向移动，我们认为这是由于氢键作用降低的缘故。另外可德胶曲线上 1644 cm-1处的吸收对应于水分子的吸收峰，不能完全消除掉，几乎大多数的多糖均是有此 现象[79-80]。对于羧甲基化可德胶的红外谱图，1370 cm-1以及891 cm-1附近处的特征吸收峰 表明改性产物仍为P -D-葡萄吡喃糖苷键构型，在1607 cm-1处的吸收峰对应于COO-的不对
41
称伸缩振动；而1432 cm-1处的吸收峰则对应于COO-的对称伸缩振动，表明了羧甲基化反 应的发生。两者谱图的比较更为详细的信息参见表3-1。
表3-1可德胶以及羧曱基化改性产物的红外吸收对应的基团（*号表示产物的特征吸收峰） Table 3-1 Infrared absorption regions and assignments for Curdlan and CMc (the symbol *
refers to the characteristic peaks of the CMc molecule)
Wavenumber (cm-1)Fragment
3370OH
2917CH CH2
1644H-O-H
1373CH
1317CH2
1261C-OH
1234C-O
1160C1-O-C3
1080C- O
1607*C=O
1432*C=O
AJIAIPnpuo0
24
ml of 0.33N HCl
8 10
3.4.2羧甲基可德胶的取代度测定
图3-3羧曱基可德胶电导率滴定法测取代度 Figure 3-3 Determine of carboxymethyl curdlan5s DS by Conductometric titration
42
称取0.234g的羧甲基可德胶放入250ml烧杯中，加入200ml去离子水，再加入3ml 0.5N 的NaOH溶液，搅拌1h-2h。用0.33N的盐酸溶液滴定，每次滴入0.3-0.4ml，充分搅拌后，
(V2 —V1)N=ValueA(7.12 _ 4.吵 0 33=3.82
Grams of samples
0.234
(Ml. of NaOH x N)-(V1x N)(2.90 x 0.5)-(4.14x0.3)_A 〇n
=Value B=0.89
Grams of samples
0.234
A x 0.162
(1 + 0.022B — 0.08 A)
DS
3.82 x 0.162
(1 + 0.022 x 0.89 — 0.08 x 3.82)
0.87
用上海第二分析仪器厂的DDS-11A型电导仪及铂黑电极测定测定溶液电导率，搅拌1分钟 后记录电导率值。将电导率与加入的盐酸体积作图，如图3-3所示。聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,由图可得Vi=4.14ml， V2=7.12ml，m=0.234g。
经过计算，合成的羧甲基可德胶的取代度为0.87。
3.4.3不同超声时间的羧甲基可德胶的分子量测定
我们用CQ-250超声仪将制备的羧甲基可德胶超声降解不同时间，以得到一系列具有不 同分子量的CMC。
超声降解是通过施加超声波，使溶液起伏产生压力。在不同的压力作用下，溶液中有气 泡生成，直径可达100 um。这些气泡达到一定尺寸后，在不到一微秒的时间内破裂，释放 出高能量（气穴现象)，使高分子在两个破裂气泡间的拉长区域内断裂（图3-4)。链的断裂 一般发生在重心附近。大分子比小分子降解得快，这是由于后者有较大的流动阻力，即当分 子量増加时降解速率也増加。当高分子的分子量下降到一个临界值后，即在一定链长以下， 力不足以破坏化学键，使分子链继续断裂。支链高分子比直链高分子难降解[81]。
43
图3-4超声降解示意图[82]
Figure 3-4. Schematic representation of the polymer degradation in an elongational flow field caused by cavitation[82].
已有研究表明，在超声降解的过程中结构单元的化学结构保持不变。如果样品是多分散 的，随降解时间的增长，多分散性略有下降。与化学降解及热降解相比，超声降解是一个相对 确定的过程，降解产物的取代度不会改变，多分散性也在一定范围内。因此我们采用超声降解 的方法，将羧甲基可德胶水溶液（lwt%)分别降解1小时、2小时、3小时，8小时，得到共 计五种不同分子量的羧甲基可德胶样品。用马尔文公司的Viscotek凝胶色谱测定四种样品的 分子量及分子量分布情况，其结果如表3-2所示。由表3-2可以看出，随着超声时间的增长， 羧甲基可德胶的重均分子量降低，虽然羧甲基可德胶的分子量与超声时间不是线性关系，但是 通过超声降解的方法可以得到一系列具有不同分子量的羧甲基可德胶样品。
表3-2羧甲基可德胶分子量随超声时间的变化
Table 3-2 Change of carboxymethyl curdlan's molecular weight with ultrasound time
Sample
IdMwMnMzIVRh/nmRadius of Gyration/nm
CMc901,860761,1251,167,0005.86542.67760.709
超声1h824,050627,9711,141,0005.379440.16951.104
超声2h757,176605,6931,025,0005.249438.81148.04
超声 3h630,214495,662843,8984.5434.76739.725
超声 8h533,418321,714814,0752.837327.60837.567
44
3.4.4羧甲基可德胶水溶液的流变学性质
1000
sed>l!soos!>
0.01 ■
口 2%
〇 3%
+ 6% ☆ 10%
0.1
10
100
100 ■：
shear rate /s'
图3-5羧甲基可德胶水溶液在30°C的稳态剪切粘度对剪切速率作图
Figute 3-5 Steady shear viscosity as a function of shear rate for carboxymethyl curdlan
solutions at 30 C
图3-5给出的是羧甲基可德胶水溶液的稳态剪切粘度随剪切速率的变化情况。对于2% 以及3%的羧甲基改性可德胶的水溶液而言，仅仅显现出轻微的剪切变稀现象；对于6%以 及10%的溶液，稳态剪切粘度在低剪切速率下缓慢降低，而在高剪切速率下下降显著，并 且随着聚合物浓度的増加，剪切变稀行为开始的剪切速率值会向低剪切速率方向变化，这 一点与大多数的聚合物溶液相类似[83]。
对于羧甲基可德胶水溶液的粘弹性谱图，如图3-6所示，表现出溶液的特性G〃>G'。随 着频率的増加，G'由于具有更高的频率依赖性，因而显著的増大。两个模量均表现出明显的 频率依赖性，对于2%溶液，G'<xra2, G〃xra，随着聚合物浓度的増大，两个指数分别背离2 和1,与通常的高分子溶液性质能够很好地吻合[84]。
45
1E-4'
1E-3'
o o 1 1 1
101 o§
rad/:9-9
〇
〇
〇
〇
〇
〇
參
•10% G
•6% G_
•3% G_
•2% G_
,G ,G,G ,G
0%% % % 16 3 2
o o o o
0.1
10
100
〇/rad s'
图3-6羧甲基可德胶水溶液模量的频率依赖性测试
Figure 3-6 Frequency dependence of G' and of carboxymethyl curdlan solutions
(2%~10%) at 30 〇C
EU/JalaEelpalolted
3.4.5羧甲基可德胶的浓度对其粒径和zeta电位的影响
图3-7加入不同浓度CMc的全脂乳体系酸化过程中粒子粒径变化图 Figure 3-7 Changes of the particle size and zeta potential during the acidification process of whole milk systems with different concentrations of CMc
将具有相同分子量和相同取代度的羧甲基可德胶（Mw=757176, DS=0.87)加入到酸性 乳体系中，配置成具有不同浓度羧甲基可德胶的酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比例 稀释在牛乳渗析液中，用动态光散射粒径分析仪(DLS, Nano ZS90 Zetasizer ZEN3690,
46
Malvern)测量在调酸过程中，粒子粒径的变化。结果如图3-7所示，全脂乳体系在酸化过程 中，随着pH值的降低，在pH 5.8-5.2之间，所测粒子粒径减小。这是因为酪蛋白胶束中有 部分a-酪蛋白和p-酪蛋白的溶出，使得酪蛋白胶束的结构发生塌陷，导致粒径值减小。在 pH降低到4.7,接近酪蛋白的等电点时，粒子粒径值发生突増，超过1叫；用肉眼可以观察 到明显的聚集现象，体系失稳。
当加入羧甲基可德胶时，在相同的pH范围内(pH 5.8-5.2)，粒子的粒径减小，这是由于 羧甲基可德胶的存在并不影响a-酪蛋白和p-酪蛋白的溶出。当pH降低到5.2左右时，粒子 粒径开始増大。此时，羧甲基可德胶与酪蛋白胶束发生静电作用，吸附于粒子表面。pH降 低，在5.2-4.0之间，酪蛋白胶束中K-酪蛋白的塌陷速率和羧甲基可德胶往胶束上的吸附速 率基本平衡，粒径变化不大。pH继续降低，当加入的羧甲基可德胶浓度不足时，不能和胶 束发生饱和吸附，胶束间的空间位阻效应减弱，体系失稳，粒径突然増大。随着羧甲基可德 胶添加量的増加，更多的羧甲基可德胶吸附到酪蛋白胶束上，所以所测的粒子的粒径也増加。 当加入0.003%的羧甲基可德胶时，可以使体系稳定到pH 4.2，当加入0.0045%的羧甲基可 德胶时，可以使体系稳定到pH 4.0左右，当加入0.008%的羧甲基可德胶时，可以将酸性乳 体系稳定到pH=3.8左右，继续増大添加CMc的浓度，当羧甲基可德胶的浓度达到0.04%时， 酪蛋白胶束在pH=3.0时也没有发生聚集。所以，加入的羧甲基可德胶的浓度越大，酪蛋白 胶束的稳定性也越好，0.008%的羧甲基可德胶不足够可以稳定全脂酸性乳饮料，0.04%的羧 甲基可德胶方可以稳定酸性乳体系。
图3-8加入不同浓度羧甲基可德胶的全脂乳体系酸化过程中粒子zeta电位变化图 Figure 3-8 Changes of the zeta potential during the acidification process of whole milk systems with different concentrations of carboxymethyl curdlan
47
将具有相同分子量和相同取代度的羧甲基可德胶（Mw=757176, DS=0.87)加入到酸性 乳体系中，配置成具有不同浓度羧甲基可德胶的酸性乳体系，将酸性乳体系按1:100的比例 稀释在牛乳渗析液中，用Malvem的Nano-ZS90 Zetasizer ZEN3690型分析仪测定在调酸过
程中，粒子zeta电位的变化。如图3-8所示，全脂乳体系在调酸过程中，由于酪蛋白胶束表 面负电荷逐渐被中和，所以粒子的zeta电位一直随pH的降低而増加。在接近等电点时，胶 束间静电排斥作用逐渐消失，同时由于随着pH的降低，酪蛋白表面的K-酪蛋白发生塌陷， 使得维持酪蛋白稳定的空间位阻作用大幅度减小。提供酪蛋白胶束间斥力的主要是空间位阻 作用，当其小于胶束间的范德华吸引力时，酪蛋白发生聚集，造成体系失稳。另外，全脂乳 体系在酸化过程中，胶束的zeta电位并不随pH值的降低而单调变化，这可能与酪蛋白胶束 在体系随pH值降低过程中，会有部分磷酸钙及部分a -和0 -酪蛋白的溶出有关。
当体系加入羧甲基可德胶时，由于带负电的羧甲基可德胶吸附到酪蛋白的表面，酪蛋白 的zeta电位在5.2左右开始降低，与前面粒径増大所述的结果一致。随着pH降低，酪蛋白 表面带的正电荷越来越多，越来越多的带负电荷的羧甲基可德胶吸附到酪蛋白表面，使其 zeta电位继续降低。继续降低酸性乳体系的pH值，氢离子浓度的増加，会屏蔽羧甲基可德 胶吸附层上的有效负电荷，使羧甲基可德胶分子链卷曲，吸附层塌陷，zeta电位増加。相同 pH下，加入的羧甲基可德胶浓度越高，体系的zeta电位越低。总之，随着羧甲基可德胶添 加量的増加，体系维持稳定的pH值趋于更低，粒子粒径愈大，zeta电位愈负，这是由于更 多的羧甲基可德胶吸附到胶束上，且所吸附的羧甲基可德胶大分子链能形成loop状负电层， 既提供了空间位阻，也提供了静电排斥的作用，因此体系得以稳定。
3.4.6羧甲基可德胶的分子量对其粒径和zeta电位的影响
将具有不同分子量的羧甲基可德胶加入到酸性乳体系中，配置成具有相同浓度 (0.008wt°%)、相同取代度（DS=0.87)，不同分子量的CMC的酸性乳体系，将酸性乳体 系按1:100的比例稀释在牛乳渗析液中，用动态光散射粒径分析仪(DLS, Nano ZS90 Zetasizer ZEN3690, Malvern)测量在调酸过程中，粒子粒径的变化。我们选取未超声的羧甲基可德胶 (Mw=901,860)和超声8小时的羧甲基可德胶（Mw=533,418)进行对比，结果如图3-9所 示。和羧甲基纤维素钠的结果相似，由于高分子量的羧甲基可德胶具有更长的分子链，长链 的羧甲基可德胶分子能够在酪蛋白胶束表面形成较大的loop圈，从而使吸附层的厚度増大， 造成粒径増大，所以高分子量的羧甲基可德胶的稳定效果更好。虽然羧甲基可德胶的分子量
48
对其酸化过程中粒子的粒径变化有一定的影响，分子量的影响也和添加量的影响类似，但是 和羧甲基纤维素的添加量相比，其作用效果明显弱于添加量的影响。
-5-
i/ lellu-os
图3-9加入不同分子量羧曱基可德胶的全脂乳体系酸化过程中的粒径变化图 Figure 3-9 Changes of the particle size during the acidification process of whole milk systems with different carboxymethyl curdlan molecular weights
图3-10加入不同分子量羧曱基可德胶的全脂乳体系酸化过程中的zeta电位变化图 Figure 3-10 Changes of the particle size during the acidification process of whole milk systems with different carboxymethyl curdlan zeta potentials
将具有不同分子量的羧甲基可德胶加入到酸性乳体系中，配置成具有相同浓度
49
(0.008wt%)、相同取代度（DS=0.87)，不同分子量的CMC的酸性乳体系，将酸性乳体 系按1:100的比例稀释在牛乳渗析液中，用Malvem的Nano-ZS90 Zetasizer ZEN3690型分
析仪测定在调酸过程中，粒子zeta电位的变化。我们选取未超声的羧甲基可德胶 (Mw=901,860)和超声8小时的羧甲基可德胶（Mw=533,418)进行对比，结果如图3-10 所示。测试结果显示，加入未超声羧甲基可德胶的酸性乳体系的zeta电位比加入超声8小 时的羧甲基可德胶的酸性乳体系的更低，说明加入高分子量羧甲基可德胶的酸性乳体系的 zeta电位更低，高分子量更有利于羧甲基可德胶稳定酸性乳饮料，这与上面讨论的结果一致。 但是与加入不同添加量羧甲基可德胶的酸性乳体系相比，加入不同分子量羧甲基可德胶的酸 性乳体系的zeta电位差异更小，所以虽然分子量对羧甲基可德胶的稳定效果有一定的影响， 但其影响效果不如添加量的影响明显。
3.4.7羧甲基可德胶，羧甲基纤维素钠稳定酸性乳饮料对比
0¬7.06.56.05.55.04.54.03.53.0
pH
2000 - 1800 - 1600 - 1400 - 1200 -
c 1000 -
§
历 800 - 600 - 400 - 200 -
10¬5¬0¬-5¬-10¬-15¬-20¬-25¬-30¬7.06.56.05.55.04.54.03.53.0
PH
图3-11羧甲基纤維素钠与羧甲基可德胶稳定酸性乳饮料对比（a为粒径变化，b为zeta
电位变化）
Figure 3-11 Comparison of stabilization of acidified milk with Sodium carboxymethyl cellulose and carboxymethyl Curdlan (a: Changes of particle size;b: Changes of zeta potantial)
羧甲基纤维素钠和羧甲基可德胶有相似的结构[85]，聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,羧甲基纤维素钠和羧甲基可德胶都 证明对酸性乳饮料体系有一定的稳定作用，那两者之间有什么异同。我们对两者稳定酸性乳 饮料进行了对比，结果如图3-11所示。加入两种不同多糖的酸性乳体系在酸化过程中，其 粒径和zeta电位变化趋势相似，说明其稳定机理相似，均是因为多糖能提供静电排斥作用 和空间位阻效应，同时多余的多糖可以増加体系的粘度。但是在酸化过程中，加入相同浓度
50
羧甲基可德胶的酸性乳体系的粒径比加入羧甲基纤维素钠的酸性乳体系的粒径小，zeta电位 也更小。同时，含0.0045%羧甲基纤维素钠的酸性乳体系可以在pH=3.25的条件下稳定存在， 0.0045%的羧甲基可德胶只能将酸性乳稳定在pH=4.1；含0.008%羧甲基纤维素钠的酸性乳 体系可以在pH=3的条件下仍稳定存在，0.008%的羧甲基可德胶只能将酸性乳稳定在 pH=3.6。所以，羧甲基纤维素钠与羧甲基可德胶相比，其对酸性乳饮料的稳定效果更好。
羧甲基可德胶与羧甲基纤维素钠结构相似，但是其对酸性乳饮料的稳定效果却不相同， 我们推测这与两者的分子链柔顺性不同相关，为此我们比较了两者的分子柔顺性的差异。持 久长度q是表示多糖高分子柔顺性的一个重要参数。持久长度q定义为无限长链的末端在起 始端第一个链轴方向上的投影，代表链的支撑能力，即表征链的刚柔程度，其值越大链的刚 性越强。一般柔性高分子呈现无规线团链构象，其q值在0.5-1.0nm之间，而刚性高分子链 的q值一般在40-200nm之间[80]。
研究者对于羧甲基纤维素钠的持续长度研究较多，只〇〇£0：^^[86]等研究证明羧甲基纤维 素钠的持续长度q与其取代度相关，计算出在NaN〇3溶液中羧甲基纤维素钠的持续长度 q=11-13nm。由于鲜有文献对羧甲基可德胶的持续长度进行计算，我们利用Viscotek凝胶 色谱测出的分子参数，运用蠕虫状链圆筒模型对羧甲基可德胶的q进行了推算。对于该模型，
Bushin[87#P Bohdanecky[88%后独立的证明 Yamakawa-Fujii-Yoshizaki 关于[n ]理论可以近似
地表示为：
An + BnMw1-
Ari=
(1 )
(2)
(3)
Bn = 〇D-1/SB0 (2q/ML)
其中
_单位长度摩尔质量nm-1 q—持久长度nm
AD,B。-常数，B。近似为常数，取BQ = 1.065
23
+B-Floiy 常数，dr彡0.1 时，中。=2.86X10
分别将四个不同分子量的可德胶的Mv._和h]带入⑴中，以%寸—条直
51
r」0-_ J、-) e、sl)
线，如图3-12所示。根据直线的斜率和截距求得At) = 130.32,= 1.04
图3-12羧甲基可德狡的(Up)与Mw1"的关系图
Figure 3-12 The plot ofagainst Mw'- ; for the carboxymethyl curdlaii
将Ai】，Bri带入式（4),
(4 )
—^(—jBn4
AQ 1.215TTKA KATJ 11
将（4)式得到的■J;：=2.98Xl〇-3 带入（5)式，得到 dr=0.064,在。=1.37,再根据（2) (3)
公式可以得到q=5.94nm。比较羧甲基纤维素钠和羧甲基可德胶的持续长度，发现羧甲基可 德胶的持续长度小于羧甲基纤维素钠，所以羧甲基可德胶比羧甲基纤维素钠更柔顺。因为羧 甲基可德胶的分子链比羧甲基纤维素钠更加柔顺，所以更容易弯曲和更好地吸附在酪蛋白表 面。羧甲基纤维素钠的分子链刚性更强，因此能提供更好的空间位阻作用，这是羧甲基纤维 素钠能更好稳定酸性乳饮料的原因。
52
3.5本章小结
(1)本文通过将可德胶羧甲基化得到羧甲基可德胶，红外测试中1607 cm-1及1432 cm-1 处的吸收峰证明了羧甲基化的成功。
(2)通过测试，测出合成的羧甲基可德胶的取代度为0.87,与上一章中取代度为0.9 的CMC的取代度相似；通过超声降解，得到了一系列相同取代度，不同分子量的羧甲基可 德胶，所以超声降解是一种得到一系列分子量的有效方法。
(3)羧甲基可德胶的流变学性质与大多数的聚合物相同，稳态剪切粘度具有剪切变稀 的现象，储能模量G’和损耗模量G”均表现出明显的频率依赖性；随着聚合物浓度的増 加，剪切变稀行为开始的剪切速率值会向低剪切速率方向变化，这一点与大多数的聚合物 溶液相类似。
(4)羧甲基可德胶也可以有效稳定酸性乳饮料，当体系pH低于5.2时，羧甲基可德 胶可以吸附在酪蛋白胶束表面，提供静电排斥作用和空间位阻作用从而稳定酪蛋白，加入羧 甲基可德胶的酸性乳体系在酸化过程的粒径与zeta电位变化趋势与羧甲基纤维素相似；加 入的羧甲基可德胶浓度越高，其对酸性乳饮料的稳定效果越好。
(5)羧甲基可德胶与羧甲基纤维素钠相比，羧甲基可德胶对酸性乳饮料的稳定效果不如 羧甲基纤维素钠的稳定效果好，这是由于羧甲基可德胶的持续长度比羧甲基纤维素的持续长 度短，其分子链柔顺性更好，其分子链刚性不如羧甲基纤维素的分子链强，因此提供的空间 位阻效应弱于羧甲基纤维素。
53
第四章玉米纤维胶稳定全脂酸性乳饮料
4.1前言
玉米纤维胶是通过过氧化氢的碱性溶液从玉米纤维中提取得到的。玉米纤维是一种来源 非常丰富并且价格低廉的玉米仁湿磨副产物，玉米纤维包括玉米仁的果皮层和胚乳细胞壁等 纤维性部分。商业化的玉米干磨加工也是玉米纤维的来源之一。研究发现[56]玉米纤维胶具 有高度支化的结构，p-(1-4)-吡喃木糖作为主链，a-L-阿拉伯呋喃糖作为侧链，另外还有一些 D-葡萄糖醛酸连接在主链木糖的O-2位置，还有一些半乳糖和木糖连接于作为侧链的阿拉 伯呋喃糖上。玉米纤维胶具有水溶性好，溶液粘度低的特点，是食品行业潜在的乳化剂[57]。 研究[89]也证明玉米纤维胶可以和乳蛋白相互作用，形成配合物，此配合物可以更好地稳定 乳化液。本文研究了玉米纤维胶稳定酸性乳饮料的情况。
4.2实验试剂和仪器
4.2.1实验试剂
表4-1模拟牛乳渗析液(SMUF)的配比
Table 4-1 The formulation of SMUF (simulated milk ultafiltration)
样品名称重量/ g样品名称重量 / g
磷酸二氢钾1.58氯化钙1.0
柠檬酸钾1.2氯化镁0.65
柠檬酸钠1.79碳酸钾0.3
硫酸钾0.18氯化钾0.6
柠檬酸及表4-1中试剂:分析纯，中国国药（集团）上海试剂公司；
全脂奶粉新西兰恒天然合作集团；
玉米纤维胶美国农业部东部研究中心的Yadav博士提供。
54
PHS-3TC 型 pH 计
4.2.2实验仪器
TA Instruments,美国;
AR-G2旋转流变仪
上海天达仪器有限公司;
动态光散射仪
85-1磁力搅拌器
上海克威电器有限公司;
马尔文仪器有限公司。
4.3实验方法
4.3.1CFG溶液的流变学测试
稳态剪切粘度及动态粘弹性实验在AR-G2旋转流变仪上进行，夹具选用角度为1°0' 22〃、直径为40 mm的锥板，锥板与平板间的间距为30叫；或者选用角度为2°' 8〃、 直径为60 mm的锥板，锥板与平板间的间距为58叫。实验温度由循环水浴及帕尔贴(peltier) 系统控制在25 °C，精度为±0.1 °C。稳态剪切速率范围0.01〜1000 s-1。动态频率扫描范围 0.01〜100 rad/s，测试均在样品的线性粘弹区内进行。为了避免实验过程中溶液溶剂的挥发， 采用一薄层轻质硅油（聚二甲基硅氧烷，25 C时粘度为10mPas)覆盖其暴露表面。
4.3.2CFG全脂酸性乳体系zeta电位测试
配制一系列乳溶液，向其加入不同量的玉米纤维胶，配制成喊不同含量CFG的酸性乳 饮料，将酸性乳饮料按1:100的比例稀释在牛乳渗析液中。在上述样品中，滴加柠檬酸，蛋 白质胶体粒子的（-电位随pH值的变化用Malvern的Nano-ZS90 Zetasizer ZEN3690型分析 仪测定，温度为25°C。
4.4结果与讨论
4.4.1 CFG的流变学
55
(s ed) Li
1E-3
0.01 0.1 1 10 100 1000
y (s-1)
图4-1是玉米纤维胶溶液的稳态剪切粘度对剪切速率的依赖关系，从图中可以看出，所 有浓度的玉米纤维胶溶液的稳态剪切粘度基本都不存在剪切速率依赖性，即使剪切速率达到 1000 s-1也没有观察到明显的剪切变稀行为，这说明玉米纤维胶溶液具有类似于牛顿流体的 特性。此外，玉米纤维胶溶液的稳态剪切粘度随着玉米纤维胶浓度的増大而増大，但是即使 玉米纤维胶浓度达到60 mg/ml，其稳态剪切粘度也只有约0.3 Pa s,说明玉米纤维胶溶液具 有低粘特性。
图4-1 25°C时玉米纤維胶溶液的稳态剪切粘度对剪切速率的依赖关系 Fig. 4-1 Steady shear viscosities of CFG solutions at 25〇C.
4.4.2加入CFG的酸性乳体系酸化过程中zeta电位的变化
图4-2是加入不同浓度玉米纤维胶的酸性乳饮料的酸化过程中的zeta电位变化。如图 所示，加入玉米纤维胶的酸性乳体系与不加玉米纤维胶的酸性乳体系相比，其zeta电位的 变化几乎一致，不同浓度CFG的酸性乳饮料的zeta电位也几乎没有差别。这说明加入CFG 对乳体系的zeta电位没有影响，CFG没有吸附在酪蛋白胶束上从而降低胶束的zeta电位。 加入CFG的酸性乳体系与前面加入CMC、CMc的酸性乳体系相比，在pH=5.2左右处（多 糖吸附在酪蛋白胶束上的pH点），其zeta电位没有发生降低，进一步印证了 CFG没有吸附 在酪蛋白胶束上，玉米纤维胶不能稳定酸性乳饮料。这可能是由于玉米纤维胶是一种高度支
56
-20¬
-25-
20¬
15¬
10-
AUJ/IEIlu^lod-El^z
化的多糖高分子，其分子结构为球状，其与酪蛋白之间的空间位阻作用使其不能吸附在酪蛋 白的表面。
-30
1| I |■|1 I 1 I 1 I 1 I ^
7.06.56.05.55.04.54.03.53.0
pH
图4-2加入不同浓度CFG的全脂乳体系酸化过程中粒子zeta电位变化图 Figure 4-2 Changes of the zeta potential during the acidification process of whole milk systems
with different concentrations of CFG
4.5本章小结
(1)玉米纤维胶溶液具有低粘性，同时具有类牛顿流体特性。
(2)玉米纤维胶是一种高度支化的多糖高分子，所以它不能像羧甲基纤维素、羧甲基可 德胶一样能吸附在酪蛋白上提供静电排斥效应和空间位阻效应，其不能作为酸性乳饮料的稳 定剂。
57
第五章全文总结
酸性乳饮料是广受欢迎的饮料，本文采用全脂酸性乳饮料为研究对象，分别研究了羧甲 基纤维素钠（CMC)、羧甲基可德胶（CMc)、玉米纤维胶（CFG)对其的稳定效果、影 响因素及稳定机理。
CMC是水溶性纤维素衍生物、最主要的离子型纤维素胶。CMC水溶液一般呈现剪切变 稀行为，粘度随剪切速率的升高而降低。溶液的粘度随浓度的増加而升高，溶液具有粘弹性， 随浓度的増加G'与G''的交点向低频移动，同时模量升高。当pH降低到5.2左右时，CMC 与酪蛋白胶束发生静电作用，吸附于粒子表面，提供静电排斥作用和空间位阻效应，这两个 效应是其稳定酸性乳饮料的主要原因。此外，没有吸附在酪蛋白上的CMC可以増加乳体系 的粘度，也可以起到稳定酸性乳饮料的作用。CMC的添加量是影响其稳定效果的关键因素， CMC的添加量越多，酸性乳体系的粒子粒径越大、zeta电位越负、沉降率越低。所以CMC 的添加量越多，酸性乳体系越稳定，0.4%的CMC足以稳定4%全脂酸性乳饮料。CMC的分 子量与取代度也是影响其稳定效果的关键因素，高分子量、高取代度的CMC对酸性乳饮料 的稳定效果更好，分子量与取代度对稳定效果的影响不如添加量的影响明显。将脱脂乳体系 与全脂乳体系相比，由于脂肪的存在，全脂酸性乳体系的粒径比脱脂酸性乳体系的粒径大， 但在酸化过程中其粒径变化和zeta电位的变化一致，说明脂肪的存在并不影响酪蛋白在酸 化过程中的溶出和塌陷，也不影响CMC与酪蛋白的相互作用。
CMc具有和CMC相似的化学结构，本文用可德胶为原料，将可德胶羧甲基化得到CMc, 并用红外测试证明CMc的形成。电导滴定法测得制备的CMc的取代度为0.87,与取代度为 0.9的CMC的取代度相似。CMc超声降解可以得到一系列不同分子量的CMc。CMc水溶液 也呈现剪切变稀行为，聚阴离子多糖稳定全脂酸性乳饮料研究,粘度随剪切速率的升高而降低，溶液的粘度随浓度的増加而升高，溶 液具有粘弹性。与CMC类似，当pH降低到5.2左右时，CMc也可以与酪蛋白胶束发生静 电作用，吸附于粒子表面从而稳定酸性乳饮料。羧甲基可德胶的添加量对其稳定效果影响较 大，羧甲基可德胶的添加量越多，酸性乳体系越稳定。将超声不同时间而得到的不同分子量 的羧甲基可德胶进行对比，高分子量的羧甲基可德胶的稳定效果更佳。由于羧甲基可德胶的 分子链持续长度比羧甲基纤维素钠的分子链持续长度小，所以羧甲基可德胶的分子刚性不如 羧甲基纤维素钠的柔顺性好，分子柔顺性的差异导致羧甲基纤维素钠能提供更强的空间位阻
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效应，所以羧甲基可德胶对酸性乳饮料的稳定效果不如羧甲基纤维素钠的稳定效果好。
玉米纤维胶不同于羧甲基纤维素钠或者羧甲基可德胶，其溶液稳态剪切粘度基本都不存 在剪切速率依赖性，玉米纤维胶溶液具有类似于牛顿流体的特性。此外玉米纤维胶溶液具有 低粘特性。玉米纤维胶和羧甲基纤维素、羧甲基可德胶的分子结构不同，它是一种高度支化 的多糖高分子，所以它不能像羧甲基纤维素、羧甲基可德胶一样能吸附在酪蛋白上提供静电 排斥效应和空间位阻效应，其不能作为酸性乳饮料的稳定剂。
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