发生与许多因素有关，而低密度脂蛋白（LDL)的 升高及由此引起LDL进入血管壁并被氧化成氧化 的低密度脂蛋白以及纤维蛋白原含量的増加，从而 破坏了内皮细胞的抗凝、屏障作用都是产生动脉粥 样硬化的主要原因12。如果能较大程度的清除纤维 蛋白原(Fib),同时又降低血液中过高的LDL含量

配制0. 2%的黄原胶溶液，分别用移液管取5 ?: 722分光光度计;恒温水浴锅（HH-2A)电s力丨sl此4此3此2 mL溶液，加入5此8 mL、9

的话，对于改善血液流变指标、改善血液状况和防治 高粘滞血症都具有积极作用131，也能有效的预防和 阻止AS发生141。目前血液LDL净化方法主要包 括血浆置换、膜过滤、免疫亲合吸附、物理化学吸附 及肝素诱导沉淀等技术而对诱导沉淀的研究多集 中于类肝素物质，如磺化多糖类物质5。

黄原胶是甘兰黑腐病黄单胞菌（Xanthomonas Camparis)所产生的一种胞外多糖，具有聚P-1，4-口比 喃型葡萄糖的主链以及含糖的侧链如丙酮酸和乙酸 基因，其聚合物骨架结构类似于纤维素，侧链上的葡 萄糖醛酸和丙酮酸群赋予了黄原胶负电荷。整个分 子结构中则含有大量的伯、仲醇羟基16。通过磺酸 基化反应可以使所得衍生物具有大量硫酸基，而以 3^氯-2-羟基丙磺酸钠为磺化试剂所得到的降解黄原 胶磺酸基化衍生物应用于血浆脂蛋白诱导沉淀技术 鲜见报道171。以该种降解黄原胶磺酸基化衍生物作 为净化剂，通过诱导沉淀的方式，调节血浆pH值， 从而使净化剂能够与LDL/Fib结合形成不溶性的 复合物而沉淀，通过过滤以达到净化血浆中LDL/ Fib的目的。

文献报道有以海藻酸钠，魔芋葡甘聚糖，降解香 豆胶等一些天然多糖为原料，通过降解和磺化，得到 一系列降解多糖磺化衍生物，运用于体外血浆净化， 都得到了良好的净化效果|wq。

本文以黄原胶为原料，通过降解、磺化获得一种 新型类肝素物质一降解黄原胶磺酸基衍生物。这 是一种聚阴离子酸性低聚糖，含有硫酸基团，具有良 好的水溶性。本文研究和讨论了磺化反应中降解黄 原胶的相对分子质量、3-氯-2-羟基丙磺酸钠用量，反 应时间对产物磺酸基含量的影响，通过实验确定了 较优的反应条件。同时以降解黄原胶磺化衍生物为 净化剂，考察其选择性清除血浆中LDL和Fib的性 能。分别研究了净化剂用量、净化体系的pH值对 净化效果的影响，确立较优的净化条件，从而证明了 降解黄原胶磺酸基衍生物是一种新型的血液净化 剂。

1材料和方法

1.1原料与试剂

黄原胶(上海化学试剂站分装厂)、新鲜猪血、透 析袋(截留相对分子质量3500,上海源聚生物科技 有限公司）、环氧氯丙烷、亚硫酸氢钠(AR，上海凌峰 化学试剂有限公司）、盐酸、醋酸钠、冰醋酸、乙醇等 试剂为市售分析纯或化学纯。

1.2主要仪器

离心机(80-2);循环水式真空泵(SH2-D型）真空干 燥箱(DZF-6020型）精密酸度计（PHS-3C型）乌 氏粘度计。

1. 3实验方法

1.3.1降解黄原胶的制备

取一定量的黄原胶分散于100 mL乙醇溶液 中，置于250 mL三口烧瓶。加入一定量的HCl溶 液恒温水浴，搅拌使黄原胶分散均匀，反应停止后抽 滤，置于烘箱中烘干。

1. 3.2 3-氯-2-羟基丙磺酸钠的制备1111

称取49.96 g环氧氯丙烷、64. 6 g亚硫酸氢钠， 量取130 mL的去离子水，置于三口烧瓶中，控制反 应温度为80 °C。滴加环氧氯丙烷，滴加的同时不断 搅拌，滴加完毕后，反应1.5 h。

反应完毕后，将烧瓶内的产物趁热倒入大烧杯 中，冷却至室温后用冷水冷却至大量的白色晶体析 出，进行抽滤，用滤液充分洗涤残留于烧杯壁的产 物，最后得纯净的白色产物。

1.3.3磺酸基降解黄原胶的制备

取1 g降解黄原胶加入装有搅拌及回流冷凝装 置的250 mL三口烧瓶中，加入40 mL乙醇溶液和 一定量的3^氯-2-羟基丙磺酸钠，于60 °C下进行磺 化反应3 h。

反应结束后将产物倒出，抽滤，得到粉状固体 于60 °C下烘干。

1.3.4纯化处理

将干燥后的磺酸基降解黄原胶溶于去离子水后 移入透析袋中，磺酸基降解黄原胶选择性清除血浆的研究,以去离子水充分透析，直至透析液以 BaCL溶液检验无SO4^检出。透析液浓缩后在50 °C下真空干燥至恒重，即获得纯净的降解黄原胶磺 酸基化衍生物。

1.3.5血浆Fib及脂蛋白的诱导沉淀

以冰醋酸和醋酸钠配制不同pH值的HAc- NaAc缓冲溶液，同时将不同量的磺酸基降解黄原 胶溶解其中，获得不同浓度不同pH值的净化剂缓 冲溶液。取一定量的血浆按1 :1体积比加入上述 净化剂缓冲溶液中，体系有沉淀物形成。于 3 000 r/min下离心分离沉淀物，取上清液分析纤维 蛋白原（Fib)、血浆总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆 固醇(HDL)及血浆总蛋白质(TP)等指标。

1.4分析指标与方法

1)降解黄原胶的相对分子质量：粘度法测 

mL、8 mL去离子水，稀释成浓度为1/2、1/3、1/4、 V5的溶液，将乌氏粘度计垂直放入恒温槽中，调节 恒温槽温度为25 °C。用移液管取10 mL去离子水 注入粘度计，待恒温后用秒表测量溶剂流经毛细管 的时间to。重复3次，每次相差不应超过0.2 s取 其平均值。取10 mL经稀释的黄原胶溶液加入粘 度计中，分别测定1/2、1/3、1/4、U5的溶液的流 出时间t1、t2、t3、t4。作lnn/c〜c图，从截距求出[n 值。

由黄原胶的半经验Mark-Houwink方程[n二 1.7X 10^XM1’14可求出黄原胶的相对分子质

量[13]。

2)测定产物磺酸基含量:硫酸钡比浊法[14。

3)血浆纤维蛋白原浓度(CFib):亚硫酸钠沉淀- 双缩脲显色法[15]。

4)血浆(血清）总胆固醇浓度（crc):乙醇抽提， 磷硫铁显色法[16]。

结果与讨论

2.1降解黄原胶的制备条件优化

黄原胶的糖苷键在碱性介质中是相当稳定的， 但是在酸性介质中容易断裂。因此可以通过改变酸 的浓度、温度，水解时间等进行酸降解得到不同的 相对分子质量(见图1)。

2.2磺化实验条件的优化

由于黄原胶粘度较大，过高的温度，反应时间过 长或反应体系水含量较多都会使反应物糊化结块， 使得反应无法进行，所以将磺化的反应温度控制在 60 C

2.2. 1黄原胶的相对分子质量对磺酸基含量的影 响

固定降解黄原胶用量为1 g反应温度为60 C 反应时间定为3 h，3-氯-2-羟基丙磺酸钠的用量为5 g。黄原胶相对分子质:

由表1可知，随着黄原胶水溶液相对分子质量 的减小，所得产物磺酸基含量更高。磺酸基降解黄原胶选择性清除血浆的研究,这是因为随着 降解，使黄原胶的有序结构向无序结构转变，从而有 利于反应物的渗入，使反应更易进行。

2.2.23-氯-2-羟基丙磺酸钠用量对磺化产物硫酸

基含量的影响 

量，所得的磺化试剂的用量对磺化产物硫酸基含量 的影响如图2

 

增大3-氯-2-羟基丙磺酸钠的用量，整个反应向 着有利于生成物的方向进行，磺化产物的硫酸基含 量增加，产物的溶解性能也有所增强。

2.2.3反应时间对产物硫酸基含量的影响

固定降解黄原胶用量为1 g反应温度定为60 C 3-氯-2-羟基丙磺酸钠的用量为8 g逐步延长反 应时间，考察反应时间对磺化产物硫酸基含量的影 响如表2。

表2反应时间对磺化产物硫酸基含量的影响

Reaction tim e/ hSO2-/%

215. 53

2.517. 63

320. 47

3. 521. 80

423.58

由表2可见，延长磺化反应的时间能增加产物 的磺酸基含量，而且反应3 h后硫酸基含量趋于稳 定，所以将反应的时间定为3 h。

2.2.4降解黄原胶磺化衍生物的红外表征

FT IR谱（图3)中的3450 cm^处有吸收峰，显 示有-OH基团的O-H键;2805 cm^处有吸收峰，显 示有-CH2或-CH3基团的C-H键伸缩振动;在1022 cm^处的吸收峰是C-O-C (糖环）的伸缩振动，在 1637 cm^附近有-COO-的特征峰，由反对称COO- 伸缩振动引起，图4中的磺化降解黄原胶在1268cm 1处的吸收峰，证明有-OSO3的S=O伸缩振 动:在830 cm^的吸收峰，显示有C-O-S键的伸缩 振动。红外光谱表明降解黄原胶与3-氯-2-羟基丙 磺酸钠发生了磺化反应，获得了黄原胶磺化衍生物。 2.3净化体系pH值和降解黄原胶磺化衍生物浓 度对血浆净化效果的影响

影响LDL诱导沉淀的主要因素包括净化剂浓 度和体系pH值。下面将分别考察两者对血浆净化 效果的影响。

2.3.1降解黄原胶磺化衍生物浓度对血浆脂蛋白 净化效果的影响

用含有不同浓度的降解黄原胶磺化衍生物的缓 冲溶液，按1 : 1体积比与已去除血细胞的血浆混合 进行净化，考察净化剂浓度（PA)对血浆脂蛋白的净 化效果。图5显示出体系pH = 5. 10时，血浆脂蛋 白净化效果随降解黄原胶磺化衍生物浓度的变化关 系。

 

图5净化剂浓度对血浆诱导沉淀净化效果的影响(n= 5) 实验中观察到，在一定pH坏境下，随净化剂浓 度增大，血浆TC及LDL净化率均有所增加。在体 系pH = 5. 10时，随着净化剂浓度的增大至2500 mg/L，可使TC下降47%左右，LDL和VLDL下降 55%左右，而对HDL的清除率在23%左右。这是 由于LDL和HDL的载脂蛋白的种类、组成及空间 结构存在较大差异所致。LDL的载脂蛋白为 apolipoprotein-B，其富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸 等碱性氨基酸残基，且多暴露于载脂蛋白表面。而 HDL的载脂蛋白为apolipoprotein-A，亦含有一定 量的赖氨酸，但其暴露在HDL分子表面的比率较 小。HDL等电点低于LDL，故在相同pH环境下， HDL所带的正电荷比LDL少。当体系pH = 5. 10 近似于LDL的等娜，可以促使LDL聚沉。另外，LDL的相对分子质量及尺寸均较HDL大，在等 电点处更容易聚集。

此外，Fib是一种纤维状蛋白质高分子，其等点 电约为pH = 5.5。当体系pH值低于其等电点时， Fib整体带正电荷，容易与聚阴离子形成复合物絮 凝沉淀出来。通过实验发现，体系pH =5.10时，当 净化剂溶度达到1500 mg/L时，在所取上清液中加 入适量的亚硫酸钠溶液均没有形成沉淀，磺酸基降解黄原胶选择性清除血浆的研究,表明此时 Fib的清除率接近100%。

同球型LDL分子相比，Fib具有特殊的纤维状 结构，并且其等电点高于LDL的等电点，因此，在相 同pH环境下，Fib所带的正电荷比LDL多，其与聚 阴离子形成不溶性复合物的能力较LDL更强。 2.3.2净化体系pH值对血浆脂蛋白净化效果的 影响

净化体系pH值影响净化剂诱导沉淀LDL及 Fib的另一个重要因素，在净化剂浓度一定的条件 下，改变净化体系的pH值，考察其对血液净化效果 的影响，结果如图6所示。

图6净化体系pH值对血浆脂蛋白净化 效果的影响(n= 5)

由图6可得：随着pH下降，TC、LDL及HDL

的清除率均将提高。这是由于体系pH环境决定了 血浆蛋白质的荷电数，故对蛋白质与净化剂相互作 用有重要的影响。而TP变化并不显著。在pH低 于5. 1后的Fib的清除率较高，所以选取pH = 5.10 作为净化的优化pH值，在此体系下能较大程度得 清除TC、LDL、Fib，而对TP及HDL的影响较小。 2.3.3净化效果测定

配制一定量的净化剂，使其浓度为2500 mg/L， 在pH = 5. 10的净化体系下，对12个血浆样本进行 净化实验，净化结果如表3所示。 

表312个血浆样本脂蛋白净化效果

CpA/mg。L—1CB/mg ° L —1CB/ g ° L-1CA/mg • L-1CA/g • L-1RP/%

TC HDL LDLFib TPTC HDL LDLFib TPTCHD LLDLFibTP

2500925 ±41 327±6 598±337. 9±0.8 81. 2±3.1508±17 248±11 261±190±0 56. 8±2.445245510030

 

[9]

本文中首先介绍用黄原胶作为载体，并以3-氯-2-羟

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3结论

1)以黄原胶为原料，首先进行酸降解再以3- 氯-2-羟基丙磺酸钠为磺化试剂，对其进行磺化，可 以获得降解黄原胶磺化衍生物。通过实验磺化反应 的较优条件为：取1 g降解黄原胶，反应温度为60 C磺化试剂3-氯-2-羟基丙磺酸钠的用量为8 g反 应时间为3 h。在此条件下产物硫酸基含量有 23.58%。红外光谱分析表明，该衍生物为新型酸性 粘多糖，是一种新型类肝素物质。

2)以这种新型降解黄原胶磺化衍生物为净化 剂，研究其选择净化血液低密度脂蛋白（LDL)及纤 维蛋白原(Fib)的性能，得到较优净化条件为：在体 系pH= 5. 10,净化剂浓度为2500 mg/ L时，可使 TC下降45 %左右，LDL和VLDL下降55%，Fib 清除率接近100%，而对HDL和TP的净化率为 24%和30%，说明该降解黄原胶磺化衍生物具有良 好的选择净化性能，是一种新型LDL/Fib净化剂。

利用多糖物质来替代肝素，从而制备出一种类 肝素低密度脂蛋白净化剂，磺酸基降解黄原胶选择性清除血浆的研究,它具有成本低，制备过程 容易等优点。同时，在同类低密度脂蛋白净化剂中， 基丙磺酸钠代替常规的氯磺酸作为磺化试剂，这样也使磺化反应过程相对比较温和。同时，根据上述血液净化的实验数据，可以证明其对于降低血浆中低密度脂蛋白和纤维蛋白原有良好的效果，是一种可行的选择性清除血浆LDL/Fib净化剂。