黄原胶（Xanthan gum)亦称黄单胞多糖，是由甘蓝黑腐病黄单胞杆菌 (決owowos )或其他黄单胞杆菌属的菌株以碳水化合物为主要原料经

发酵产生的高分子酸性胞外杂多糖，其生物合成机制为“非模板合成机制” [1]。

黄原胶分子是由“五糖重复单元”结构聚合体[2]，黄原胶分子彼此间靠氢键形成 双股的二级螺旋立体结构[3]；双股螺旋结构间靠微弱的非共价键结合，排列成整齐的 “超级接合带状”的三级螺旋聚合结构[4]；在极稀（<1 %)的水溶液中，不加热时黄 原胶呈现典型的四级菊花状聚集结构[5]。

王德润等利用透射电镜实验观察了单个黄原胶分子形貌，从而证明黄原胶分子 由40余个亚基组成了右手双螺旋结构[5]，随后又用GPC方法研究了黄原胶水溶液中 的构象，发现在缔合态和分子态之间存在动态平衡，缔合态为多分子分段两两缔合呈 右旋双螺旋构象[6]。赵大健等用特性粘度法算得黄原胶的相对分子质量是2.41405 g/mol [7]，王德润等利用透射电镜的实验方法，计算出黄原胶的相对分子质量是6x106 g/mol〜25^106 g/mol [5]，用光散射法测定的黄原胶的相对分子质量是2.36x106 g/mol [6]。赵大键等利用超声波切断技术处理天然黄原胶，得到一系列分子量不同的试样， 经小角度激光散射法（SALLS)测得黄原胶相对分子质量，以其为作为标样，用GPC 法测得了天然黄原胶的相对分子质量和其对应的分子量分布[8]。黄原胶的分子结构见 图1.1。

 

n

O

图1.1黄原胶的分子结构 Fig.1.1 molecular structure of Xanthan gum

1.2黄原胶的生物合成

现已有多位研究人员Coplin和Leigh等对黄原胶的微生物合成途径进行了阐述。 如图1.2所示，黄原胶的合成，从五元糖重复单元结构的装配开始，然后将这些重复 单元结构聚合生成大分子。五元糖装配的第一步是UDP-葡萄糖上1-磷酸糖基转移到 多萜磷酸盐上然后再逐个按序将其他糖残基转移上去，D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸分 别来自GDP-甘露糖和UDP-葡萄糖醛酸，从而得到完整的与脂相连接的五元糖重复单 元，并且黄原胶链的增长发生在还原末端。生物合成的最后一步，是将黄原胶从细 胞膜上分泌出去。穿过周质和外膜分泌到胞外环境的过程还没有得到完全的阐述。 这个转运的过程需要能量，并且可能是通过一个特殊的转运系统，这个系统保证将 高聚物从脂类载体上释放出来并且进行跨膜转运。在野油菜黄单胞杆菌野油菜致病 变种決owowas1 ca—es/r/s pv.中，Vanderslice和Vojnov指出黄原胶

的生物合成分别有12个不同的基因组成的基因簇（从即mB到即mM)相互协调指导。 现今参与黄原胶合成的许多基因已经被鉴定、分离和表征[9]。

2 

 

图1.2黄原胶生物合成示意图 Fig.1.2Xj3inthan gum biosynthesis diagram

3

 

1.3黄原胶发酵工艺的研究

1.3.1菌种对黄原胶发酵质量的影响

黄原胶发酵的菌种一般采用野油菜黄单胞杆菌，此类菌株一般呈杆状，产荚膜， 有极性鞭毛，无芽抱，专性好氧，革兰氏染色阴性菌[10]。

现如今生物技术的迅速发展，可以通过基因工程技术来培育菌种，它将目的基 因通过一定的生物技术方式导入受菌体内，然后筛选出能够表达目的基因的菌株[11]。 Pollock等[12]将与黄原胶相关的乙酰基、丙酮酸、多聚体等目的基因导入不同种属的 黄原胶生产菌中实验，结果显示所生成的黄原胶特性与原菌株产生的黄原胶基本相 同。Chou等[13]认为即mD基因与菌株色素合成有关，如能切除该基因，则可得到无 色黄原胶。姚仕仪等[14]通过构建一株基因工程菌又CC见409275,研究了野油菜黄单 胞菌重组克隆尸/^9275对黄原胶合成的影响，结果显示黄原胶产量比亲本增加了 7.14%。

1.3.2碳源/氮源（C/N)对黄原胶发酵质量的影响

张禹等研究发现C/N对发酵速度、发酵周期有重要的影响，从对数生长期开始， 采用较高的C/N (大约50: 1)促进黄原胶的合成。同一批黄原胶发酵周期的延长， 丙酮酸含量不断的增加。因此，C/N通过控制生长速度将其作用传递给丙酮酸的合 成[15]。

I.W.sutherland研究认为，对于好气菌来说，高氧量和低C/N比值促进细菌生长， 相对低的氧量和高C/N比值则利于胞外多糖合成。Garcia-Ochoa、Schweickart和

Quinlan也普遍认为较高的氮源浓度对于较快的微生物生长和较高的微生物浓度是有 利的[16]，然而较高的碳源浓度对于黄原胶的合成更加有利。

基于黄原胶发酵过程中微生物生长和产物合成不同阶段对C/N需求不同， Yang-Ming Lo将G/YE (葡萄糖/酵母浸粉）的两阶段发酵工艺应用于黄原胶发酵过 程中：发酵刚开始时利用较低的G/YE (2.5%/0.3%)，当对数生长期结束的时候一次 添加额外的葡萄糖（2.5%)，从而创造一个较高的G/YE环境，发酵所得的黄原胶质 量与间歇发酵G/YE (5.0%/0.3%)和半连续发酵（发酵刚开始时利用较低的G/YE (2.5%/0.3%)，当对数生长期结束的时候，额外的葡萄糖（2.5%)是在稳定期内分

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五次留加完成的，每次间隔五小时）相比，两阶段发酵都优于间歇发酵和半连续发 酵[17]。

这样不论是在对数生长期还是在稳定期都分别创造了合适的微生物生长和产胶 环境，发酵过程中分别出现了较快的微生物生长和较高的黄原胶产率，同时 Yang-Ming Lo为了确定是否仅有G/YE是影响发酵的重要因素还是是否酵母浸粉的 浓度也是局定因素。另外一个两阶段试验：培养基中G/YE是1.5%/0.18%，但是G/YE 与G/YE为2.5%/0.3%是相同的。当微生物进入稳定期以后，一次性流加额外的3.5% 的葡萄糖从而为发酵环境创造一个较高的G/YE (5.0%/0.18%)。结果显示菌体生长 速率和黄原胶产率与较高浓度时的酵母浸粉发酵相比都要低，较低的黄原胶产率是 由于进入稳定期后较低的菌体浓度造成的。很明显，单独的G/YE并不能决定黄原胶 发酵，也需要培养基中酵母浸粉浓度保持在一个合适的水平[17]。

1.3.3无机盐对黄原胶发酵质量的影响

丙酮酸含量是黄原胶产品的一项重要质量指标。丙酮酸含量越高，黄原胶的性 能越好。张禹等研究发现，无机盐对黄原胶中的丙酮酸含量有不同程度的影响。当 限制了 Ca2+或NH4+的浓度时，丙酮酸含量降低幅度较少，当限制K+或Mg2+浓度时， 丙酮酸含量有明显下降，当限制Fe3+浓度时，丙酮酸含量得到提高[17]。张国佩等研 究发现，适当的微量元素，特别是适宜的元素组合对黄原胶菌种的生长代谢、多糖 积累有明显的促进作用，综合比较Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、B5+六种元素的 组合对黄原胶的合成效果最好[18]。

I.W.Sutherland在阐述微生物胞外多糖的生物合成时指出，微生物胞外多糖分子 结构中的丙酮酸是在多糖“重复单元”在细胞膜内C55-Lipid-P糖基载体脂上合成时 组入的。磷酸烯醇式丙酮酸既是菌体细胞有氧呼吸产生的ATP的重要中间物质，又是 为微生物胞外多糖提供丙酮酸非糖基组分的供体[1,19]。刁虎欣等人的研究表明，经正 交试验选择的最佳摇瓶发酵条件，结果表明，碳源、氮源、无机盐和通气量皆是影 响黄原胶丙酮酸的含量的极显著因素。其中氮源和通气量又是这四种极显著因素中 的最显著因素[20]。这与I.W.Sutherland报道的氮源和通气量是影响微生物胞外丙酮酸 含量的结果一致[19]。组成的产生高丙酮酸含量黄原胶的最佳发酵条件是：蔗糖2%、 玉米淀粉2%、豆饼粉0.5%、K2HPO40.5%、MgSO4*7H2O 0.02%，pH 7.0，自来水配 制，接种量2%，摇床转速240 r/min[20]。

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赵润宝等人在发酵过程中添加游离丙酮酸研究显示：明显提高了所产黄原胶分 子中的丙酮酸功能基团的含量，添加3.0 g/L的游离丙酮酸可以使黄原胶分子中丙酮 酸功能基团的含量有4.74%提高到了 5.29%，提高11.6%，且不影响黄原胶的产胶率， 达到33.9 g/L。同时指出游离丙酮酸最佳的添加时间为发酵开始后24 h[21]。

I.W.Sutherland在综述微生物胞外多糖生物合成和调控时指出，依赖于 C55-Lipid-P糖基载体脂的微生物胞外多糖合成，其分子链长度与C55-Lipid-P运载糖 基的效率有关。微生物细胞生长速度越慢，C55-Lipid-P运载糖基效率越高，多糖的 聚合度越高[1]。轻质CaCO3是最佳的无机盐，轻质CaCO3的生理功能，既可作为缓 冲剂，调节发酵过程中的pH，控制细胞的生长，其解离出的极少量Ca2+也可能作为 聚合酶的促进因子，提高聚合酶的活性，提高黄原胶的聚合度，提高黄原胶的分子 量降]。

1.3.4搅拌速度和溶氧对黄原胶质量的影响

由于黄原发酵液流变学的复杂性，搅拌速度影响的不仅是发酵液的运动状态还 有氧的传质速率，搅拌作用包含对溶液的剪切稀化和空气的作用，两者是相互作用 的。在黄原胶发酵过程中，随着发酵的进行胞外多糖的不断积累，导致发酵液的粘 度也来越大，因此，把溶氧分成两个阶段：（1)气液的混合；（2)溶解于液体中的氧 穿透胞外多糖顺利运输到细胞内。

Flores, Suh曾报道黄原胶质量受到氧摄入比速率的显著影响，Amanullah认为氧 摄入比速率的变化依赖混合的程度。因此，当黄原胶的浓度超过20 g/L时，在较低 的搅拌速率下，可能会产生相对差的混合，从而导致较差的黄原胶质量，因此搅拌 对于黄原胶质量的提高起着至关重要的作用[23]。Moraine和Rogovin，Kennedy以及 Funahashi认为这是由于黄单胞杆菌周围胞外多糖的不断积累，增加了氧气和其他营 养物质运输的阻力，当增加搅拌速度的时候产生的有利作用的原因是：使胞外的多 糖层变薄，从而提高了黄原胶形成所必需的氧和营养物质的运输[24]。然而，Perters 提出：第一，胞外多糖层并不存在，第二，溶氧限制可以被避免（增加转速或者利 用纯氧代替部分空气），黄原胶生成比速率并没有受到搅拌速度和剪切力的影响。这 里需要重要指出的是上述实验的黄原胶产率最终没有超过16 g/L，并且，发酵液中 并没有静止区的出现[25]。

M. Papagianni利用实验室2L的发酵罐，在pH没有控制的前提下，对黄单胞

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杆菌dTUC 1395的黄原胶间歇生产和生长动力学进行了研究，发酵分别在不同的的 揽拌转速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min)下发酵，保证在 72 h在速度100 r/min的时候不低于饱和度的5%，同时在600 r/min时不低于饱和度 的10%。结果显示搅拌转速在600 r/min时，与转速在200 r/min时相比，黄原胶产 量和菌体浓度几乎分别增加两倍，并将胞外多糖中的丙酮酸和其分子量关联起来。 黄原胶有效的生成是在600 r/min，在这个速度下，能保证一个较好的溶氧[2]。这些 与作者前期的研究一致：要想获得较高的产量，较高的溶氧是必需的。Amanullah在 其研究中也阐述道，当黄原胶浓度达到20 g/L时，微生物的氧摄入速率更快，所以 搅拌转速为1000 r/min时（与转速为500 r/min相比），黄原胶的产量增加。生物量 随着搅拌速度的增加而增加，然而在Amanullah的报道中当搅拌速度500 r/min与 1000 r/min相比，并没有引起生物量的变化[23]。

在不同的生长阶段，产生的黄原胶分子的分子量和取代程度是不同的，因此， 发酵结束后所得到的黄原胶是不同结构分子的混合物。

Peters利用15 L机械搅拌生物反应器在不同搅拌速度（200 r/min〜800 r/min) 下实验发现，在较低的搅拌速率下，溶氧限制较早的出现，发酵生产出的黄原胶的 平均分子量（Mw)也会越低[25]。

I.S.Suh利用鼓泡柱（Suh和Pons指出鼓泡柱具有良好混合性，不存在停滞区）， 利用不同的通气速率（U〇=0.051m/s、0.100 m/s、0.165 m/s、0.361 m/s):黄原胶分

子量的大小受氧传递速率限制的影响较大，有时与其呈线性关系，不同通气速率下 分别发酵，最初的黄原胶平均分子质量相差很大，但在对数生长期结束时（30 h)平 均分子质量迅速的增加到相似的最大值（8.8x106 g/mol〜9.4x106 g/mol)，黄原胶的 浓度仅为6.7 g/L。进入稳定期后，黄原胶平均分子质量下降，下降的速率与通气速 率有显著的关系（通气速率较低条件下发酵所得黄原胶平均分子质量与通气速率较 高条件下发酵所的黄原胶平均分子质量相比，前者进入稳定期后，下降更为迅速）， 其研究还显示，在较低的通气速率下（UG =0.051 m/s)时，分别在t=30 h和t=154 h 所得黄原胶分子量分布表明：t=30 h (对数生长期刚结束时）所得黄原胶离散度比 t=154 h所得黄原胶离散度要小，并且前者所得黄原胶分子量在7x106 g/mol〜4x107 g/mol中所占的含量比后者多[26]。

II-Soon Suh 研究表明在 Synthentic (BC-4)和 Complex (BC-3)不同发酵培养

基中发酵发现，对数生长期结束前，BC-3培养基发酵所得的黄原胶平均分子质量明

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显优于BC-4培养基发酵所的黄原胶平均分子质量，但进入稳定期后，BC-3培养基 发酵所得的黄原胶平均分子质量急剧的下降，质量明显不如BC-4培养基发酵所得的 黄原胶平均分子质量，其原因是由于其不必要的高生物量致使对溶氧的需求得不到 满足，不仅使黄原胶的产量下降，更正要的是导致黄原胶质量的下降[27]。

对于发酵过程中的对数生长期黄原胶平均分子质量达到最大值，其后随着发酵 进入稳定期，黄原胶平均分子质量下降，本文作者究其原因：牛淑敏研究发现最先 分泌黄原胶的都源于菌体的端部，这可能是由于这个部位是新生壁，比较薄的缘故 [28]。这段期间，营养物质和溶氧在没有胞外多糖的积累的环境中的运输相对较易， 聚合酶使的黄原胶的主链不断的增长，此时黄原胶平均分子量达到最大值，随着发 酵的进行，牛淑敏也观察到，细胞的周围开始不断的大量分泌黄原胶[28]，随着胞外 多糖的积累，营养物质和溶氧的运输阻力增大，主链增长的速度减缓，从而导致黄 原胶平均分子质量下降。

Fernado Flores在2 L的机械搅拌式生物反应器内研究结果表明：虽然影响黄原 胶生物合成机理尚不清楚，但是发酵液中高的溶氧浓度有利于黄原胶分子的聚合时 非常明显的。发酵液中的溶氧浓度还会影响到黄原胶的产率及其平均分子量和分子 量分布[30]。相同实验证明，溶氧浓度越高其黄原胶的生物合成开始的越早，而黄原 胶生成的停止通常是由于培养基中碳源的耗尽造成的，从某种意义上讲，高浓度黄 原胶发酵液的得到必须有较高的溶氧浓度为前提的[29]。

用HPLC测得的黄原胶分子量显示不受搅拌速度增加（100 r/min和600 r/min) 而受到影响，在这两组实验中，黄原胶的分子量都在5x105 g/mol左右[2]，但需要指 出的是600 r/min发酵结束时其黄原胶最终产量仅为6.3 g/L。

分子量并不仅仅是决定黄原胶质量的参数，尽管它在研究中是首先考虑的。丙 酮酸含量对其特定的应用具有更重要的影响作用[31]。M.Papagianni研究表明在发酵 的72小时，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，对于不同搅拌速度（100 r/min〜600 r/min)下，利用HPLC对其丙酮含 量测定发现，其随着搅拌速度的提高而增加，众所周知，丙酮酸含量主要依赖菌株 和培养基的选择[2]。Peters提出了微生物对氧的需求和丙酮酸含量两者之间存在着直 接的联系。较高的速度将会提高溶氧水平，而丙酮酸依赖氧的供给，从而解释了在 较高的搅拌转速下得到较高的丙酮酸含量[25]。  

1.4黄原胶发酵工程的研究

姚恕、李卫旗[32]通过对黄原胶在不同发酵罐的实验，阐述了发酵罐的罐体高径 比、搅拌器、桨叶直径与挡板、通气量及加热系统控制等因素对发酵的影响。

1.4.1不同搅拌体系对黄原胶发酵质量的影响

Peters等利用三层Inter-Mig桨搅拌对黄原胶发酵实验，当搅拌转速低于6.67 s-1时，

会发生发酵液供氧不足的现象，导致发酵结束时黄原胶的产量和黄原胶平均分子量 有很大程度的下降；若保持总气量不变，通过通入部分纯氧代替先前的部分空气， 最终的实验结果表明不仅发酵液中的溶氧水平明显增加，更重要的是黄原胶的浓度 有了显著的提高，因此在黄原胶发酵的中后期，溶氧是影响黄原胶产量和质量的重 要因素。

本实验室苗伟等对两层组合桨在黄原胶水溶液中的混合性能进行了较详细的系 统研究，通过气含率、容积传氧系数和功耗这三个参数的实验和分析，对各种组合 桨之间进行了比较。得出的实验结果发现：上层的双折叶下压圆盘涡轮和下层的凹 叶圆盘涡轮组合具有低能耗、高气含率的特性；上层的双折叶圆盘涡轮和下层的六 叶布鲁马金组合桨有利于获得高的容积传氧系数；因而在高浓度的黄原胶溶液中， 底层桨加大直径可获得较高的气含率，有利于非牛顿流体中气液传质和混合[33]。

1.4.2气体分布器对黄原胶发酵质量的影响

在传统气体分布器的基础上，改进的气体分布器不仅使分散出的气体尽可能小， 延长气体在发酵液中的滞留时间，同时加大了气液接触面积，从而增加溶氧推动力。

张炎等发现在气液混合反应的过程中，气泡直径的大小往往对最终的实验结果 起了决定性的作用。减小从气体分布器出来后的气体的直径，促进气液间的传递，从 而加快反应的进程。在实验过程中，通过在气液搅拌式反应器上安装了一种特殊的 气体分布器，通过搅拌产生离心场，从而诱导生成泰勒涡柱。从而减少了气泡间的凝 并作用，气泡尺寸减小，与对照组相比，反应器中最小的气泡尺寸减小了近50%，气泡 的比表面积增加近80%。与对照实验比较，在使用特殊气体分布器的反应器中，氧的 传递系数增加了 10%〜40%，证明这种气体分布器确实可以增加气液间氧的传递[34]。  

洪厚胜等[35]设计了一种新型气升环流反应器，其研究结果表明：新型气升环流 反应器比机械搅拌式发酵罐更适合于高粘度培养物的发酵。

1.4.3挡板对黄原胶发酵质量的影响

本实验室盛春琦通过对发酵过程中有无挡板以及窄挡板的研究发现：随着发酵 的进行，特别是到了发酵的中后期，发酵液中出现了停滞区，致使停滞区中溶氧和 营养物质运输阻力加大，不仅导致黄原胶产量下降，更重要的是导致黄原胶分子量 的下降以及丙酮酸含量的降低，这一研究结果与李卫旗等研究的在传统平叶搅拌器 发酵设备中，适当减小挡板数目或不设挡板更有利于黄原胶高粘性物系发酵的研究 结果一致[36]。

1.5黄原胶分离提取 1.5.1发酵液的预处理

该工序主要是去除菌体细胞和各种不溶性杂质，这些杂质会影响产品的质量和色 泽。预处理的方法有很多，主要有离心法、硅藻土过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化法、 亚硫酸钠漂白法、超滤、减压蒸馏等。其中硅藻土过滤法除杂质的效果较好，因为硅 藻土有较小的颗粒度、较大的比表面和表观能，表面呈多孔状，极易吸附溶液中较小的 固体颗粒，经过滤处理，就能使菌体杂质与硅藻土一起除去。实验证明：硅藻土过滤法 对去除菌体有显著效果。但回收率低，最佳过滤条件为发酵液等倍稀释，硅藻土用量为 原发酵液的0.1%[37]。用蛋白酶和溶菌酶对发酵液进行降解，可除去菌体残骸等蛋白质 不溶物。这种方法使所得的黄原胶具有较好的粘度和透光度。此提纯工序可以减少稀 释、抽滤、离心分离这些复杂的步骤，最重要的是能提高产品的纯度。

1.5.2黄原胶的提取

根据黄原胶的提取程序的不同，可分为粗制和精制两种，而精制品又分为工业级和 食品级。它们的提取方法不同，粗制品可用直接干燥法提取，此法会使黄原胶含有大量 的菌体残骸等固体不溶物，因而使其经济价值和应用受到影响。精致品的提取方法有多 种，主要有有机溶剂（乙醇、异丙醇、甲醇）沉淀法、无机阳离子钙盐沉淀法、铝盐沉

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淀法、酸沉淀法、有机阳离子季铵盐沉淀法以及药处理方法等，在这些方法中，尤以乙 醇沉淀法、钙盐一乙醇沉淀法效果较好。

1.5.2.1乙醇沉淀法[37]

乙醇和发酵液混合，当混合液中乙醇的浓度超过50%时，黄原胶能以纤维状沉淀的 形式由混合液中提取出来。其原理为：低级醇的加入能降低黄原胶分子与水溶液间的 亲和力，使它变为黄原胶分子间亲和力。在较高的醇浓度下，使之相互结合凝结而形成 沉淀。在以低级醇沉淀黄原胶的过程中，还可部分的洗脱掉发酵液中的色素，外源盐类 及菌体细胞。淄博中轩集团已建成年产15000吨的食品级的黄原胶的生产线。其提取 路线为：

发酵液乙醇沉淀一乙醇洗涤脱色一-挤压一-打散——真空干

燥11

I —回收乙醇返回

11

—回收乙醇—粉碎——包装—成品

研究表明，黄原胶溶液中加入Na+、K+等阳离子也节省醇的用量。当KCI的浓度在

0.2%〜1%之间时，随KCI浓度的增高，醇的用量降低;控制pH为5.5时，乙醇的加入量 只需为发酵液超滤浓缩后的体积的1.2倍，乙醇用量减少。

1.5.2.2钙盐沉淀法

在碱性条件下，钙离子能与黄原胶形成黄原胶钙盐复合物沉淀。该复合物沉淀经酸 性醇沉淀处理，可使钙离子解离，将黄原胶钙盐复合物沉淀转变为黄原胶的醇沉淀。常 见的钙盐有氯化钙、氢氧化钙、氯化镁等。具体操作为：在发酵液中加入氯化钙和氢 氧化钠，充分搅拌使形成黄原胶钙盐复合物叶凝胶状沉淀，过滤脱水后加入酒精、盐酸 洗涤沉淀，过滤后再加入少许酒精洗脱、干燥。

1.5.3沉淀物的烘干

经沉淀回收到的黄原胶湿品中，因含有可燃性的有机溶剂，应采用分批或连续的真 空干燥、压力空气干燥及惰性气体干燥法进行烘干。烘干温度一般为50°C〜80°C，要求  

含水量降至10%以下。烘干的温度过高会导致产品的颜色变深，在水中的溶解时间增长 和粘度降低。常用的干燥方法有转筒烘烤干燥法、喷雾干燥法以及瞬间快速干燥法等。

1.6研究内容及意义

现如今世界上黄原胶均采用发酵法生产，一般采用的是间歇式的生产工艺，生 产装置最大可达到几十立方米。由于黄单胞杆菌体积很小、强度很低，黄原胶的发 酵过程是一个比较典型的气液两相混合生化反应过程。

目前国内厂家多采用了多层直叶圆盘涡轮等不恰当的反应器内部构件，难以满 足黄原胶发酵过程中溶氧和传热、传质的需要，因此生产中存在的问题正是我们需 要研究的方向，很显然，要全面解决黄原胶生产技术中存在的问题，首先应该从发 酵工程的角度入手，并引用化学工程中处理高粘度体系的成功方法，进行以下几方 面的工作：

本实验通过对不同搅拌桨的冷模实验，选出了两组消耗功率较小，而气含率和 XLa值较高的桨型组合：上层桨为下压式双折叶圆盘涡轮（P2DTD)，下层桨为六叶 布鲁马金（6BM)和单独最大叶片桨（MB)，将这两组桨型应用于机械搅拌式生物 反应器黄原胶的发酵，针对发酵过程中黄原胶发酵动力学参数：OD、黄原胶浓度、 粘度、平均分子质量、丙酮酸功能基团以及残糖参数的测定与传统的六直叶圆盘涡 轮（6DT)进行了对比研究，以期得到一组适合黄原胶等高粘性物系发酵的新型搅拌 桨，进而开发适合于黄原胶等高粘性物系发酵的新型机械搅拌式生物反应器。

第一部分：通过对三种不同搅拌体系下黄原胶发酵动力学参数：OD、黄原胶浓 度、粘度、平均分子质量、丙酮酸功能基团以及残糖的测定，验证了冷模条件下组 合桨（上层下压式双折叶圆盘涡轮，下层六叶布鲁马金）体系和最大叶片式桨体系 具有高气含率和优良传质性能的结论，更重要的是为工业上提高黄原胶发酵产量和 发酵质量（黄原胶平均分子质量和丙酮酸功能基团的含量）提供理论指导

第二部分:利用实验室30L发酵罐，在对pH控制的前提下，对黄单胞杆菌XG-101 的黄原胶间歇生产和生长动力学进行研究，发酵在一系列的搅拌速度（140 r/min〜260 r/min)下进行，其中产品的丙酮酸功能基团含量和分子量得到了测定，随着搅拌转 速的增加，发酵动力学各项参数分别增加，同时，黄原胶在发酵过程中的形成也与 微生物的生长有一定的关系。另外，本实验也对溶氧变化对黄原胶发酵的影响作了

12

研究。

第三部分：利用黄原胶发酵过程中，黄单胞菌的生长繁殖和黄原胶的合成对营 养物质的需求不一样，改变发酵过程中培养基C/N比值，即，黄原胶补料分批发酵， 提供了两个合适的环境：一个是微生物生长，另一个是黄原胶合成，通过对MB搅 拌体系下黄原胶发酵动力学参数：OD、黄原胶浓度、粘度、平均分子质量、丙酮酸 功能基团以及残糖的测定，不仅验证了最大叶片式桨体系具有高气含率和优良传质 性能的结论，更重要的是提高了黄原胶发酵产量和发酵质量，与传统的间歇发酵相 比优势更加明显。  

2不同搅拌体系下黄原胶发酵

2.1前言

在黄原胶的生物发酵生产过程中，由于黄原胶高粘特性，导致发酵的中后期发 酵液粘度大，通常在黄原胶含量为2 g/L时，其溶液粘度即可达到4000 cp以上[2]。 随着黄单胞杆菌分泌到自身胞外多糖的积累，给发酵过程中的气液混合、溶氧传递、 营养物质传递以及热量的传递等带来了很大的困难，因此，这一问题是目前制约黄 原胶发酵生产提高的主要因素，而且对黄原胶的质量和发酵液的流变特性等产生至 关重要的影响[3,38,39]。因此，改变当今国内生产黄原胶普遍使用的六直叶涡轮搅拌桨 体系，延长气体在生物发酵罐内的停留时间，提高全罐的混合效率，研究和开发出 适合黄原胶这种高粘性物系发酵的新型生物反应器，对于解决黄原胶发酵过程中存 在的上述问题，有着重要的现实意义。

针对上述问题，本实验通过对不同搅拌桨的冷模实验[33]，选出了两组低功耗高 气含率和较高XLa值的桨型组合：上层桨为下压式双折叶圆盘涡轮（P2DTD)，下层 桨为六叶布鲁马金（6BM)和单独最大叶片桨（MB)，将这两组桨型应用于机械搅 拌式生物反应器黄原胶的发酵，针对发酵过程中各参数的变化与传统的六直叶圆盘 涡轮（6DT)组合桨进行了对比研究。

2.2实验材料与方法 2.2.1菌种

囷种：实验室保存囷种。

2.2.2实验仪器

乌氏粘度计上海尼润智能科技有限公司

14

DV-2+PRO数字式粘度计上海尼润智能科技有限公司

全自动生物反应器 MSJ-叱B.E.MARUBISHICO.LTD., JAPAN；

2.2.3培养基[40]

2.2.4实验及生物反应器运行条件

2.2.4.1培养方法[40]

2.2.4.2发酵过程中黄单胞杆菌的菌体形态观察结果[36]

2.2.5分析方法及原理 2.2.5.1发酵液中菌体浓度的测定分光光度计652 nm处测定OD值。

2.2.5.2发酵液粘度的测定DV-2+PRO数字式粘度计，室温，27号转子下测定。 2.2.5.3黄原胶浓度的测定

用70°%以上的乙醇重复沉淀黄原胶三次，然后60°C真空干燥，然后准确称量所 得黄原胶样品的干重，黄原胶的质量浓度（g/L)=黄原胶的干重（g) /发酵液的体积 (L)

2.2.5.4还原糖、淀粉浓度的测定斐林试剂法[41]

2.2.5.5丙酮酸含量的测定[2,40]

2.2.5.6黄原胶分子量的测定[5,40]

15 

 

 

 

六直叶圆盘涡轮（6DT)

下压式双折叶圆盘涡轮（P2DTD) 

 

 

 

最大叶片式桨（MB) 六叶布鲁马金（6BM) 

16

 

2.3实验结果及讨论

2.3.1不同搅拌桨体系对黄原胶发酵液中微生物量的影响

 

图2.1 XG-101菌株生长曲线

Fig.2.1 The growth curve of XG-101

如图2.1，在发酵时间为24 h〜36 h时，黄单胞杆菌的生长曲线随发酵时间不断上 升，三种体系下的微生物分别进入稳定期，MB (最大叶片式搅拌桨）发酵体系下的 菌体生长量在进入稳定期后，明显优于P2DTD+6BM (上层双折叶圆盘涡轮搅拌桨+ 下层六叶布鲁马金搅拌桨）组合的发酵体系下的微生物生长量，并且随着时间的推 进，不同搅拌体系下的微生物量都有不同程度的下降，但MB发酵体系下的微生物量 下降相对较小，究其原因是因为冷模研究表明，MB搅拌桨体系下与其他组合桨体系 下相比，MB体系具有较高的溶氧水平，上述实验所获的实验结论与华璟薇研究结果 一致[42]。

17 

(loss崧蠢«

 

〇〇 IT—T——T ■ I ■ I ■ I I I ■ I ■ I ■ I ■ I I I

* 010 20 30 40 506070 80 90 100

发酵时间（h)

 

图2.2发酵液中黄原胶浓度随时间的变化 Fig.2.2 Relationship between xanthan concentration and fermentation time

黄原胶属胞外次级代谢产物[43]，随着黄原胶的生成并在发酵液中的积累，导致发 酵液粘度增加迅速，限制了溶氧氧和其他营养物质的传递，从而制约了黄原胶发酵 液浓度的继续增加。如图2.2所示，78小时后发酵液中黄原胶浓度继续增加， P2DTD+6BM和MB体系下黄原胶浓度的增长幅度高于6TD+6TD。P2DTD+6BM和 MB都具有较好的气液分散效果，在一定程度上克服了黄原胶发酵中后期存在的上述 问题。

2.3.3不同搅拌桨体系对发酵液中黄原胶粘度的影响

18 

 

Fig.2.3 Relationship between viscosity and fermentation time

图2.3可见，P2DTD+6BM和MB体系下发酵中后期发酵液的粘度高于6TD+6TD 体系发酵液的粘度，通常黄原胶发酵液的粘度与黄原胶的平均分子量和浓度之间存 在着正相关的关联。从图2.2和图2.4可以看出，P2DTD+6BM和MB体系下发酵液 中黄原胶浓度的增加与其平均分子质量的增加均高于6TD+6TD体系，根据黄原胶发 酵液粘度与黄原胶浓度、平均分子量间的正相关关系，因此只有在黄原胶浓度相似 的条件下，黄原胶发酵液的粘度才会随黄原胶平均分子量的增加而增加。

19

 

图2.4发酵黄原胶平均分子质量随时间的变化 Fig.2.4 Relationship between xanthan gum average molecular weight and fermentation time

正如图2.4所示，P2DTD+6BM和MB体系下发酵所得黄原胶质量明显优于 6TD+6TD体系发酵所得黄原胶质量，其中MB体系下发酵所得黄原胶质量最佳，其 最终其平均分子质量高达：1.21xi〇7 g/mol，而6TD+6TD和P2DTD+6BM体系下最 终所得黄原胶平均分子质量分别为：6.6x1〇6 g/mol、9.83x1〇6 g/mol。三种发酵体系下 黄原胶平均分子量均在其对数生长期结束时达到最大值：7.5x1〇6 g/mol、1.1x1〇7 g/mol、1.3x1〇7g/mol，随着发酵时间的进行，黄原胶平均分子质量一直下降，结果与 I.S.Suh和II-Soon Suh的实验结果吻合[3-4]。

20

5.8■

 

5.5■

5.48■

5.24■

5.16■

6DT+6DT(M) 6DT+6DT(S) P2DTD+6BM(MP2DTD+6BM(S) MB

不同发酵体系

图2.5不同搅拌体系下发酵所得黄原胶中丙酮酸功能基团含量 Fig.2.5 Relationship between pyruvic acid functional groups concentration and fermentation time

图2.5结果显示，P2DTD+6BM (M=Movement)和MB体系下发酵所得丙酮酸

功能基团含量明显高于6TD+6TD (M)体系，并且，同一发酵体系下运动区丙酮酸 功能基团含量明显高于停滞区：6TD+6TD (M)> 6TD+6TD (S) P2DTD+6BM (M=Movement)> P2DTD+6BM (Stagnancy)。因此，实验结果显示，对于具有较

高溶氧水平的P2DTD+6BM和MB发酵体系，所得丙酮酸功能基团含量明显较高。

本实验结果也显示：不同发酵体系下较好的溶氧水平是保证较高丙酮酸功能基 团含量的重要因素。

21 

4.0

 

0102030405060708090100

发酵时间（h)

图2.6发酵液中淀粉含量随时间的变化 Fig.2.6 Relationship between amylum concentration and fermentation time

图2.6所示，6TD+6TD体系下最终发酵液中淀粉浓度高于MB和P2DTD+6BM 体系。碳源不仅是合成黄原胶的最基本物质，也是黄单胞杆菌生长繁殖的物质基础， 黄原胶的浓度与碳源种类和底物浓度有着直接的关系。以淀粉质为原料的发酵初始， 由于淀粉的酶解和液化，培养基中生成适量的葡萄糖，此后随着菌体的迅速繁殖， 其分泌的胞外淀粉酶含量也随着增加，淀粉被逐渐水解为葡萄糖，发酵液中淀粉浓 度随之降低，葡萄糖浓度增加，黄单胞杆菌根据自身对葡萄糖需求的多少，来产生 胞外淀粉酶，从而使发酵液中的葡萄糖浓度处于最适。

22 

 

图2.7发酵液中葡萄糖含量随时间的变化 Fig.2.7 Relationship between glucose concentration and fermentation time

如图2.7所示，实验中黄原胶发酵结束时MB和P2DTD+6BM体系发酵液中的 葡萄糖含量基本相同，均下降到0.5 g/100mL左右，均比6TD+6TD体系下的葡萄糖 含量（0.81 g/100mL)低，MB和P2DTD+6BM体系下的葡萄糖含量明显低于 6TD+6TD体系下的葡萄糖含量，发酵液中生成的葡萄糖一些用来维持微生物正常的 新陈代谢，另外，就是用来合成黄原胶，正如图2.2所示，MB和P2DTD+6BM体系 下发酵所得黄原胶产量比6TD+6TD体系下的产量高很多。

2.4结论

本章在最佳发酵工艺条件下，针对不同搅拌桨组合对黄原胶发酵过程的影响进 行了研究，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，得出以下结论：

1、上述实验验证了冷模实验下的结论：MB和P2DTD+6BM体系具有较高的 XLa值和气含率。

2、在MB和P2DTD+6BM体系下较好的宏观稳定流型、较高的传质系数，增加 了发酵液中黄原胶的浓度，提高了底物淀粉的转化率，减少了最终发酵液中淀粉的

残留量。

3、P2DTD+6BM体系下发酵推动了更大范围的液体，降低了静止区的厚度，尤

23

其值得一提的是，MB体系下发酵几乎不存在滞留区，MB和P2DTD+6BM体系下 不仅提高了最终黄原胶发酵产量，更重要的是提高了黄原胶平均分子质量和丙酮酸 功能基团的含量。

24

3搅拌和溶氧对黄原胶发酵的影响

3.1前言

由于黄原发酵液流变学的复杂性，搅拌速度影响的不仅是发酵液的运动状态还 有氧的传质速率，搅拌作用包含对溶液的剪切稀化和空气的作用，两者是相互作用 的。在黄原胶发酵过程中，随着发酵的进行胞外多糖的不断积累，导致发酵液的粘 度也来越大，因此，把溶氧分成两个阶段：（1)气液的混合；（2)溶解于液体中的氧 穿透胞外多糖顺利运输到细胞内。Flores,Suh曾报道黄原胶质量受到氧摄入比速率的 显著影响，Amanullah认为氧摄入比速率的变化依赖混合的程度。因此，当黄原胶的 浓度超过20 g/L时，在较低的搅拌速率下，可能会产生相对差的混合，从而导致较 差的黄原胶质量，因此搅拌对于黄原胶质量的提高起着至关重要的作用[23]。Moraine 和Rogovin，Kennedy以及Funahashi认为这是由于黄单胞杆菌周围胞外多糖的不断 积累，增加了氧气和其他营养物质运输的阻力，当增加搅拌速度的时候产生的有利 作用的原因是：使胞外的多糖层变薄，从而提高了黄原胶形成所必需的氧和营养物 质的运输[24]。

黄原胶溶液展现出来的流变学特性是由其化学结构、分子排布和分子间的缔合、 平均分子量和分子量的分布共同决定的。很多微生物其发酵动力学和多糖的产率、 分子量以及它们的结构都受到生长环境的影响[3,38,39]。虽然大多数胞外多糖的基本碳 链结构不受生长环境的影响，但是其侧链结构基团是会发生很大的变化，如：黄原 胶侧链的丙酮酰基和乙酰基含量。丙酮酸功能基团是黄原胶分子侧链末端甘露糖上 的一个组成部分，在黄原胶分子中只是部分侧链上带有丙酮酸功能基团，如果全部 侧链均带有丙酮酸功能基团，则黄原胶中丙酮酸功能基团的含量达到理论最大值 (8.69%) [21]。丙酮酸含量的变化会影响黄原胶大分子的空间排列、电荷在大分子上 的分布以及大分子的交联，引起黄原胶溶液粘度、耐温性、和分子量的变化，从而 赋予黄原胶许多独特的流变性和功能特性。黄原胶有许多优良而独特的性能，但最 基本的是增稠性。其增稠性与黄原胶的分子量密切相关，分子量越大，黄原胶溶液

25

的粘度越高。根据黄原胶的生物合成机理，黄原胶的分子量依赖于黄原胶生物合成 时的聚合度，而聚合度又与发酵条件有关[19]。

在黄原胶的生物发酵生产过程中，由于黄原胶具有高粘度的特性，导致发酵液 中后期粘度大，通常当发酵液中的黄原胶含量为2 g/L时，其粘度即可达到4000 cp 以上。随着黄单胞杆菌分泌到自身胞外多糖的积累，给发酵过程中的气液混合、溶 氧传递、营养物质传递以及热量的传递等带来了很大的困难，由于搅拌和溶氧是影 响黄原胶发酵的重要因素，尤其对黄原胶的质量：粘度、分子量大小、分子量分布、 丙酮酸含量、流变特性等产生至关重要的影响，因此，本试验从搅拌转速和溶氧的 改变对黄原胶发酵进行研究。

利用实验室30 L发酵罐，在对pH控制的前提下，对黄单胞杆菌XG-101的黄原 胶间歇生产和生长动力学进行研究，发酵在一系列的搅拌速度（140 r/min〜260 r/min) 下进行，其中产品的丙酮酸功能基团含量和分子量得到了测定，随着搅拌转速的增 加，发酵动力学各项参数分别增加，同时，黄原胶在发酵过程中的形成也与微生物 的生长有一定的关系。另外，本实验也对溶氧变化对黄原胶发酵的影响作了研究。

3.2实验材料与方法

3.2.1菌种

同 2.2.1

3.2.2实验仪器

同 2.2.2

3.2.3培养基

同 2.2.3

3.2.4实验及生物反应器运行条件

同 2.2.4

26

3.2.5分析方法及原理

同2.2.5方法

3.2.6反应器内部结构

 

最大叶片式桨（MB)新型气体分布器

3.3实验结果及讨论

3.3.1不同搅拌桨体系对黄原胶发酵的影响 3.3.1.1不同搅拌转速对发酵液中微生物量的影响

27

 

图3.1 XG-101菌株不同搅拌转速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下的生长曲线 Fig.3.1 The growth curve of XG-101 time-courses in fermentation performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

M. Papagianni利用实验室2L的发酵罐，在pH没有控制的前提下，对黄单胞 杆菌dTUC 1395的黄原胶间歇生产和生长动力学进行了研究，发酵分别在不同的的 揽拌转速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min)下发酵，保证在 72 h在速度100 r/min的时候不低于饱和度的5°%，同时在600 r/min时不低于饱和度 的10°%。结果显示搅拌转速在600 r/min时，与转速在200 r/min时相比，黄原胶产 量和菌体浓度几乎分别增加两倍，并将胞外多糖中的丙酮酸和其分子量关联起来。 黄原胶有效的生成是在600 r/min，在这个速度下，能保证一个较好的溶氧[2]。这些 与作者前期的研究一致：要想获得较高的产量，较高的溶氧是必需的。Amanullah在 其研究中也阐述道，当黄原胶浓度达到20 g/L时，微生物的氧摄入速率更快，所以 搅拌转速为1000 r/min时（与转速为500 r/min相比），黄原胶的产量增加。生物量 随着搅拌速度的增加而增加，然而在Amanullah的报道中当搅拌速度500 r/min与 1000 r/min相比，并没有引起生物量的变化[23]。

如图3.1所示，菌体生长曲线随发酵时间不断上升，在36小时，分别进入稳定期， 转速为200 r/min的菌体浓度比转速为140 r/min时的菌体浓度要高，并且随着转速的继 续增加260 r/min时两个相差不再明显，结果也显示随着转速的增加，较高转速下的 发酵体系微生物稳定期相对较长，另一方面也说明较高的转速具有较高的溶氧水平，

28

与华璟薇研究结果一致：发酵液中的溶氧浓度对菌体生长速率影响不大，但是对菌 体浓度达到最大之后的菌体的稳定期的长短却有着明显的影响。当溶氧浓度只有饱 和浓度的6.25%，即DO=6%时，此稳定期只有9个小时；而当溶氧浓度为其饱和值的 25%时，即DO=25%，此稳定期可达28个小时以上。通常当发酵液溶氧浓度过低时， 稳定期短，说明菌体的呼吸受到限制，菌体活力受到影响[30]。

3.3.1.2不同搅拌转速对发酵液中黄原胶浓度的影响

 

图3.2黄原胶浓度在不同搅拌转速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下随发酵时间的变化 Fig.3.2 Xanthan concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

由于黄原发酵液流变学的复杂性，搅拌速度影响的不仅是发酵液的运动状态还 有氧的传质速率，搅拌作用包含对溶液的剪切稀化和空气的作用，两者是相互作用 的。因此，当黄原胶的浓度超过20 g/L时，在较低的搅拌速率下，可能会产生相对 差的混合，从而导致较差的黄原胶质量，因此搅拌对于黄原胶质量的提高起着至关 重要的作用[14]。如图3.2所示，发酵结束时搅拌转速200 r/min和260 r/min时的产量 分别为:2.82 g/100mL 和 2.95 g/100mL，而转速 140 r/min 时的产量仅为 2.14 g/100mL， 由此可见，随着搅拌转速的提高，黄原胶产量迅速的增加，当搅拌转速上升到一定 的转速时，产量增加变化便不再显著。对于黄原胶产量的迅速提高Moraine和

29

Rogovin，Kennedy以及Funahashi认为这是由于黄单胞杆菌周围胞外多糖的不断积

累，增加了氧气和其他营养物质运输的阻力，当增加搅拌速度的时候产生的有利作 用的原因是：使胞外的多糖层变薄，从而提高了黄原胶形成所必需的氧和营养物质 的运输[8]。

3.3.1.3不同搅拌转速对发酵液中黄原胶粘度的影响

 

图3.3黄原胶粘度在不同搅拌转速(140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下随发酵时间的变

化

Fig.3.3 Xanthan viscosity time-courses in

fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

如图3.3所示，随着搅拌转速的增加，200 r/min和260 r/min发酵体系下发酵中 后期黄原胶发酵液的粘度高于140 r/min发酵体系发酵液的粘度。通常黄原胶发酵液 的粘度与黄原胶的浓度、平均分子量之间有着正相关的关系。对照图3.2和图3.4可 以看出，200 r/min和260 r/min发酵体系下发酵液中黄原胶浓度的增加与其平均分子 质量的增加均高于140 r/min发酵体系，根据黄原胶发酵液粘度与黄原胶浓度、平均 分子量间的正相关关系，只有在平均分子量相近的条件下，黄原胶发酵液的粘度才 会随其浓度的增加而增加。

3.3.1.4不同搅拌转速对黄原胶平均分子质量的影响

30

 

图3.4黄原胶平均分子质量在不同搅拌转速 (140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下随发酵时间的变化 Fig.3.4 Xanthan average molecular weight time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min

在不同的生长阶段，产生的黄原胶分子的分子量和取代程度是不同的，因此， 发酵结束后所得到的黄原胶是不同结构分子的混合物。Peters利用15 L机械搅拌生 物反应器在不同搅拌速度（200 r/min〜800 r/min)下实验发现，在较低的搅拌速率下， 溶氧限制较早的出现，发酵生产出的黄原胶的平均分子量（Mw)也会越低[25]。Flores, Suh曾报道黄原胶质量受到氧摄入比速率的显著影响，Amanullah认为氧摄入比速率 的变化依赖混合的程度。因此，在黄原胶发酵过程中，随着发酵的进行胞外多糖的 不断积累，导致发酵液的粘度也来越大，把溶氧分成两个阶段：（1)气液的混合；（2) 溶解于液体中的氧穿透胞外多糖顺利运输到细胞内。随着搅拌转速的增加，使胞外 的多糖层变薄，从而提高了黄原胶形成所必需的氧和营养物质的运输。

正如图3.4所示，当搅拌转速分别为140 r/min、200 r/min和260 r/min时，在发 酵时间60h,黄原胶平均分子质量分别达到最大：1.1x107 g/mol、1.44x107 g/mol和 1.48X107 g/mol，其后随着发酵的进行，黄原胶平均分子质量一直下降，发酵结束时 的黄原胶平均分子质量依次为：9.012x106 g/mol、1.337x107 g/mol 和 1.391x107 g/mol, 结果显示，随着搅拌转速的提高，黄原胶平均分子质量也在提高，同时，通过图3.5 趋势线发现，发酵中后期200 r/min和260 r/min时的黄原胶平均分子质量下降的趋势

31

明显小于140 r/min时的下降趋势。结果与I.S.Suh和II-Soon Suh的实验结果吻合[3-4]。

对于发酵过程中的对数生长期黄原胶平均分子质量达到最大值，其后随着发酵进入 稳定期，黄原胶平均分子质量下降，本文作者给出了合理解释[40]。

3.3.1.5不同搅拌转速对丙酮酸功能基团含量的影响

7 I-

 

140r/min200r/min260r/min260r/min(T)

不同发酵体系

图3.5丙酮酸功能基团在不同搅拌转速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下92小时的含量 Fig.3.5 Pyruvic acid functional groups concentration of 92 h xanthan samples from fermentations carried out at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

M. Papagianni研究表明在发酵的72小时，对于不同搅拌速度（100 r/min〜600 r/min)下，利用HPLC对其丙酮含量测定发现，其随着搅拌速度的提高而增加，众 所周知，丙酮酸含量主要依赖菌株和培养基的选择[6]。实验结果如图3.5所示，随着 搅拌转速的提高，丙酮酸功能基团含量也在增加。Peters提出微生物对氧的需求和丙 酮酸含量两者之间存在着直接的联系：较高的速度将会提高溶氧水平，而丙酮酸依 赖氧的供给，从而解释了在较高的搅拌转速下得到较高的丙酮酸含量[7]。本实验结果 也显示：在较高转速下获得的较高的溶氧水平是保证较高丙酮酸功能基团含量的重 要因素。 3.3.1.6不同搅拌转速对发酵液中碳源浓度的影响

32 

—■一 140 r/min —•— 200 r/min —▲— 260 r/min

-4-2-0-8-6-4-2-0-8 3-3-3-2-2-2-2-2-1-

(1〇102/§}«^«诞

 

. I. I. I. I. I. I. I. I. I. I

0102030405060708090100

发酵时间（h)

 

1.2

图3.6淀粉浓度在不同搅拌转速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下随发酵时间的变化 Fig.3.6 Amylum concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

图3.6所示，200 r/min和260 r/min发酵体系下最终发酵液中淀粉浓度低于140 r/min发酵体系。碳源不仅是合成黄原胶的基质，也是菌体增殖的物质基础，黄原胶 的产量与碳源种类和底物浓度有着直接的关系。通常发酵液中淀粉浓度、葡萄糖浓 度、产物的浓度之间存在着一种动态平衡。以淀粉质为原料的黄原胶发酵初始，由 于淀粉的液化，培养基中存在少量的葡萄糖，此后随着菌体的迅速繁殖，其分泌的 胞外淀粉酶活力也随着增加，淀粉被逐渐水解为葡萄糖，发酵液中淀粉浓度随之降 低，葡萄糖浓度增加。

33 

—■—140 r/m

—200 r/m 一▲一 260 r/m

1-1-1-0-0- (1S00T/-埘兹海擗解

 

04 -

■ i ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I

01020 30 405060 70 8090 100

发酵时间（h)

图3.7还原糖浓度在不同搅拌转速（140 r/min, 200 r/min and 260 r/min)下随发酵时间的变化 Fig.3.7 Glucose concentration time-courses in fermentations performed at 140 r/min, 200 r/min and 260 r/min.

 

在任何微生物发酵过程中，根据生物反应动力学原理，当发酵液中的底物下降 到一定浓度时，菌体代谢速率非常缓慢，在工业生产中可以结束发酵。如图3.7所示， 黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，实验中黄原胶发酵结束时200 r/min和260 r/min发酵体系中的葡萄糖含量均下降到 0.56 g/100mL左右，均比140 r/min发酵体系下的葡萄糖含量（0.87 g/100mL)低。碳 源一部分用来构成细胞成分，一部分维持正常的新陈代谢，另外一部分用于目的产 物的合成，200 r/min和260 r/min发酵体系下的残糖含量明显低于140 r/min发酵体 系下的残糖，这些一部分用来维持微生物正常的新陈代谢，另外，就是用来合成黄 原胶，正如图3.2和图3.4所示，200 r/min和260 r/min发酵体系下发酵所得黄原胶 产量和平均分子质量比140 r/min体系下的产量和平均分子质高很多。

3.3.2溶氧对黄原胶发酵的影响

I.S.Suh利用鼓泡柱（Suh和Pons指出鼓泡柱具有良好混合性，不存在停滞区）， 利用不同的通气速率（UG=0.051m/s、0.100 m/s、0.165 m/s、0.361 m/s):黄原胶分

子量的大小受氧传递速率限制的影响较大，有时与其呈线性关系，不同通气速率下 分别发酵，最初的黄原胶平均分子质量相差很大，但在对数生长期结束时（30 h)平 均分子质量迅速的增加到相似的最大值（8.8x106 g/mol〜9.4x106 g/mol)，黄原胶的

34

浓度仅为6.7 g/L。进入稳定期后，黄原胶平均分子质量下降，下降的速率与通气速 率有显著的关系（通气速率较低条件下发酵所得黄原胶平均分子质量与通气速率较 高条件下发酵所的黄原胶平均分子质量相比，前者进入稳定期后，下降更为迅速）， 其研究还显示，在较低的通气速率下（UG =0.051 m/s)时，分别在t=30 h和t=154 h 所得黄原胶分子量分布表明：t=30 h (对数生长期刚结束时）所得黄原胶离散度比 t=154 h所得黄原胶离散度要小，并且前者所得黄原胶分子量在7x106 g/mol〜4x107 g/mol中所占的含量比后者多[26]。

Fernado Flores在2 L的机械搅拌式生物反应器内研究结果表明：当控制发酵过 程的溶氧在相对溶氧浓度DO=40°%以上时，黄原胶的平均分子量可达10x106 g/mol， 而且其产物中高分子量聚合物的比例随着溶氧浓度DO值的增加而增加[29]。虽然影 响黄原胶生物合成机理尚不清楚，但是发酵液中高的溶氧浓度有利于黄原胶分子的 聚合时非常明显的。相同实验证明，溶氧浓度越高其黄原胶的生物合成开始的越早， 而黄原胶生成的停止通常是由于培养基中碳源的耗尽造成的，从某种意义上讲，高 浓度黄原胶发酵液的得到必须有较高的溶氧浓度为前提的[30]。

在化工生产中，通气机械搅拌式反应器得到了广泛的应用，尤其是在发酵工业 当中，大多数反应器是这种类型。但在工业具体应用中，常常会遇到一些特殊情况。 例如在黄原胶发酵过程中，由于胞外多糖的积累，发酵液的粘度增加，导致体系中 氧传递困难，氧传递速率成为控制整个过程的关键步骤。虽然增大搅拌转速可以提 高体系内的溶氧水平，但高剪切的机械搅拌很容易对微生物造成损害。这就对发酵 工艺的改善、新型生物反应器的开发及其内部构件(搅拌桨、气体分布器等）的优化 提出了新的要求。目前，文献中对反应釜内部构件中搅拌桨的研究较多，而有关气 体分布器的报道相对较少。传统分布器型式有：单孔直管分布器、环状多孔分布器、 多孔环簇分布器和锥形多孔分布器等，其中最常用的是环状气体分布器。冯连芳等 曾用小于桨径的环状分布器和大于桨径的分布器进行过研究。结果发现，使用大直 径分布环要优于小直径分布环。张炎等研究了一种带有静态混合器喷嘴的气体分布 器，认为这种分布器型式有利于形成泰勒涡柱，使平行于搅拌轴方向的流体没有速 度梯度，不存在返混作用，大量气泡能有序的运动，减少了气泡间的碰撞和聚并， 有利于气液相界面积的增加[34]。

本实验是在生物反应器内其他设备和发酵条件不变的前提下，通过改变气体分 布器的结构，从而改变气泡的大小，进而促使发酵液中溶氧浓度发生变化，进而间

35

接的研究溶氧的变化对黄原胶发酵的影响。

通过新型气体分布器(见3.2.6)与传统环状分布器的比较发现，新型气体分布器 来改变溶氧，使分散出的气体尽可能小，不仅可以延长气体在发酵液中的滞留时间， 同时加大了气液接触面积，从而增加溶氧推动力，这对于反应器内部构件的优化和 黄原胶发酵质量的提高最具有重要的意义，为其他行业中高粘体系的发酵提供了理 论指导和思路。

表格3.1溶氧对黄原胶发酵的影响(92h)

Tab.3.1 Effect of agitator speed and dissolved oxygen on xanthan fermentation

最大叶片 式桨黄原胶含量 (g/100mL)黄原胶粘度

(cp)黄原胶平均分子 质量 (g/mol)丙酮酸功能基团 含量 (%)

260 r/m(T)2.531782.51.21x1075.5

260 r/m(N)2.9524571.39x1076.2

实验结果如表3.1所示，在相同转速下，260 r/min(New)发酵体系与260 r/min

(Traditional)发酵体系相比，各项发酵动力学参数明显优于后者，可见溶氧对于黄 原胶发酵质量有着至关重要决定作用。

3.4结论

利用实验室30 L发酵罐，在对pH控制的前提下，对黄单胞杆菌XG-101的黄 原胶间歇生产和生长动力学进行研究，发酵在一系列的搅拌速度（140 r/min〜260 r/min)下进行，结果显示：

1、随着搅拌转速的增加，发酵动力学各项参数分别增加，同时，黄原胶在发 酵过程中的形成也与微生物的生长有一定的关系。

2、菌体生长曲线随发酵时间不断上升，在36小时，分别进入稳定期，转速为 200 r/min的菌体浓度比转速为140 r/min时的菌体浓度要高，并且随着转速的继续增 加260 r/min时两个相差不再明显。

3、结果也显示随着转速的增加，较高转速下的发酵体系微生物稳定期相对较 长，另一方面也说明较高的转速具有较高的溶氧水平，与华璟薇研究结果一致：发

36

酵液中的溶氧浓度对菌体生长速率影响不大，但是对菌体浓度达到最大之后的菌体 的稳定期的长短却有着明显的影响。

4、本研究通过新型分布器与传统环状分布器的比较发现，改进的新型气体分 布器来改变溶氧，使分散出的气体尽可能小，不仅可以延长气体在发酵液中的滞留 时间，同时加大了气液接触面积，从而增加溶氧推动力，这对于反应器内部构件的 优化和黄原胶发酵质量的提高最具有重要的意义，同时，为其他行业中高粘体系的 发酵提供了理论指导和思路。

37

4黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究

4.1前言

一般来说，黄单胞菌的生长繁殖和黄原胶的合成对营养物质的需求是不一样的， Davidson研究表明较高的C/N比更有利于黄原胶的合成，一个相对较高的氮源浓度 是微生物的快速生长和较高的菌体浓度所必需的，而其更加有利于缩短发酵周期。 然而，Souw、Demain以及Kenndy等研究表明培养基中氮源的浓度太高的话，对黄 原胶的发酵也非常不利。Quinlan认为发酵期间菌体生长和黄原胶合成受不同阶段被 耗尽的两种基质限制。黄原胶的浓度受授葡萄糖浓度的限制，然而菌体的浓度基本 上受可以利用氮源浓度的限制。Pinches和Pallent也指出速率和得率两个参数是独立 于最初的氮源的浓度的，但稳定期黄原胶合成比速率依赖于培养基中的最初的氮源 浓度。因为培养基中组成对于黄原胶发酵的矛盾影响，现在工业发酵黄原胶在微生 物生长和黄原胶合成两阶段提供合适的培养基。

I.W.sutherland研究认为，对于好气菌来说，高氧量和低C/N比值促进细菌生长， 相对低的氧量和高C/N比值则利于胞外多糖合成。研究者们也普遍认为较高的氮源 浓度对于较快的微生物生长和较高的微生物浓度是有利的[16]，然而Garcia-Ochoa和 Schweickart以及Quinlan认为较高的碳源浓度对于黄原胶的合成更加有利。张禹等 研究发现C/N对发酵速度、发酵周期有重要的影响，从对数生长期开始，采用较高 的C/N (大约50: 1)促进黄原胶的合成。同一批黄原胶发酵周期的延长，丙酮酸含 量不断的增加。因此，C/N通过控制生长速度将其作用传递给丙酮酸的合成[15]。

基于黄原胶发酵过程中微生物生长和产物合成不同阶段对C/N需求不同， Yang-Ming Lo将G/YE (葡萄糖/酵母浸粉）的两阶段发酵工艺应用于黄原胶发酵过 程中：黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，发酵刚开始时利用较低的G/YE (2.5°%/0.3°%)，当对数生长期结束的时候一次 添加额外的葡萄糖（2.5%)，从而创造一个较高的G/YE环境，发酵所得的黄原胶质 量与间歇发酵G/YE (5.0°%/0.3°%)和半连续发酵（发酵刚开始时利用较低的G/YE (2.5°%/0.3°%)，当对数生长期结束的时候，额外的葡萄糖（2.5°%)是在稳定期内分

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五次留加完成的，每次间隔五小时）相比，两阶段发酵都优于间歇发酵和半连续发 酵[17]。

这样不论是在对数生长期还是在稳定期都分别创造了合适的微生物生长和产胶 环境，发酵过程中分别出现了较快的微生物生长和较高的黄原胶产率，同时 Yang-Ming Lo为了确定是否仅有G/YE是影响发酵的重要因素还是是否酵母浸粉的 浓度也是局定因素。另外一个两阶段试验：培养基中G/YE是1.5%/0.18%，但是G/YE 与G/YE为2.5%/0.3%是相同的。当微生物进入稳定期以后，一次性流加额外的3.5% 的葡萄糖从而为发酵环境创造一个较高的G/YE (5.0%/0.18%)。结果显示菌体生长 速率和黄原胶产率与较高浓度时的酵母浸粉发酵相比都要低，较低的黄原胶产率是 由于进入稳定期后较低的菌体浓度造成的。很明显，单独的G/YE并不能决定黄原胶 发酵，也需要培养基中酵母浸粉浓度保持在一个合适的水平[17]。

因此本实验黄原胶补料分批发酵，刚开始葡萄糖浓度为22.2 g/L, 24 h时后一次 流加额外的剩余葡萄糖（整个过程中保持与前期实验中碳源含量不变)，从而为发酵 提供了两个合适的环境：一个是微生物生长，另一个是黄原胶合成，与传统的间歇 发酵相比优势更加明显。

4.2实验材料与方法

4.2.1菌种

同2.2.1

4.2.2实验仪器

同 2.2.2

4.2.3培养基及补料方法

发酵培养基：葡萄糖（刚开始22.2 g/L，24 h时一次流加额外的22.2 g/L)，豆粉 8 g/L，CaCO3 3 g/L，初始 pH 7.3。

为了保持与前期实验中碳源含量不变，因此40 g的淀粉完全水解理论生成的葡 萄糖为44.4 g，转化公式为：纯淀粉通过完全水解，因有水解增重的关系，每100 g

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淀粉能生成111.11 g葡萄糖，如下面反应式所表示：（C5HiQ〇5)n+nH2〇—nC6Hi2〇6, 因此葡萄糖的理论收率为111.11%。

4.2.4实验及生物反应器运行条件

同 2.2.4

4.2.5分析方法及原理

同2.2.5方法

4.2.6反应器内部结构 

 

最大叶片式桨（MB)

 

新型气体分布器

40

 

4.3实验结果及讨论

4.3.1补料分批发酵工艺对发酵液中微生物量的影响

 

图4.1 XG-101菌株不同碳氮比下的生长曲线 Fig.4.1 The growth curve of XG-101

I.W.sutherland研究认为，对于好气菌来说，高氧量和低C/N比值促进细菌生长， 相对低的氧量和高C/N比值则利于胞外多糖合成。

如图4.1所示：发酵刚开始的36小时中，菌体的生长明显优于传统的间歇发酵， 但从图4.2的数据看出：在黄原胶发酵的初期，补料分批发胶中的黄原胶产量要低于 传统的间歇发酵，这是因为黄原胶补料分批发酵过程中，前期的的C/N比值较低， 更有利于黄单胞菌的生长繁殖。因此，黄原胶补料分批发酵的初期，MB搅拌体系中 的高氧量和低C/N比值促进细菌生长，其中补料分批发酵体系，在对数生长期结束 的时候，OD值高达1.22,远远高于传统的发酵体系，野油菜黄单胞杆菌为好氧细菌， 所以氧气对于细菌生长和生产黄原胶来说是必需的。通常发酵液中的溶氧浓度影响 到黄原胶产生菌的生长速率、黄原胶的生成率以及黄原胶的质量，因此，高浓度细 菌随着黄原胶发酵的进行，黄单胞杆菌胞外的黄原胶不断的积累，导致发酵液粘度 不断增大，体积传质系数降低，造成供氧能力逐渐下降，高浓度的微生物需要大量 的溶氧来维持其正常的新陈代谢，但发酵后期溶氧水平的下降直接导致黄原胶发酵

41

质量和产量的下降，如图4.4中看到的随着发酵时间的进行，黄原胶平均分子质量达 到最高点后有所下降。由此可以看出，前期较低的C/N比值虽然可以得到较高的微 生物量，为后期获得较高的生产速率得到保障，但其后期对高氧量的需求造成的溶 氧水平的下降，直接导致微生物产生胞外多糖体系对氧需求的正常平衡的打破，从 而导致了发酵后期黄原胶产量和质量的急剧下降。

(Is)蟹蠢軾

 

0102030405060708090100 110

发酵时间(h)

4.3.2补料分批发酵工艺对发酵液中黄原胶浓度的影响

图4.2发酵液中黄原胶浓度随时间的变化 Fig.4.2 Relationship between xanthan concentration and fermentation time

I.W.sutherland研究认为，对于好气菌来说，高氧量和低C/N比值促进细菌生长， 相对低的氧量和高C/N比值则利于胞外多糖合成。Garcia-Ochoa、Schweickart和

Quinlan也普遍认为较高的氮源浓度对于较快的微生物生长和较高的微生物浓度是有 利的[16]，然而较高的碳源浓度对于黄原胶的合成更加有利。

黄原胶属次生代谢产物，代谢产物的合成是在菌体浓度接近或达到最高后才开 始的[28]。黄原胶发酵过程初期表现为低粘度的牛顿体系，随着胞外多糖不断的形成 和积累，发酵液粘度逐渐的增大，在后期呈现为高粘度的假塑性非牛顿体系，限制 了氧的传递和其他营养物质的交换，影响黄原胶产量的进一步提高。

如图4.2所示，随着发酵时间的进行，黄原胶浓度不断的增加，随着黄单胞杆

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菌胞外多糖的不断积累，溶氧和营养物质的传递变得困难起来，黄原胶产生速率开 始下降，当发酵进行到84小时，黄原胶产率变化不再明显。发酵的前24小时，此 期间为黄单胞杆菌的对数生长期，菌体的繁殖和生长占主导，因此三种不同搅拌体 系下的黄原胶浓度差别不明显，发酵时间24小时之后，由于一次流加额外葡萄糖导 致碳源浓度的瞬间增加，发酵液中的C/N比值达到较高，有利于产物黄原胶的形成， 因此，黄原胶间歇发酵与黄原胶补料分批发酵过程中后期相比，发酵液中黄原胶浓 度差别越来越大，到发酵结束时间歇发酵和补料分批发酵所得到的黄原胶浓度为2.96 g/100mL、3.28 g/100mL。

4.3.3补料分批发酵工艺对发酵液中黄原胶粘度的影响

 

图4.3发酵液黏度随时间的变化 Fig 4.3 Relationship between viscosity and fermentation time

通常黄原胶发酵液的粘度与黄原胶的浓度、平均分子量之间有着正相关的关系。 对照图4.2和图4.4可以看出，黄原胶补料分批发酵下，发酵液中黄原胶浓度的增加 与其平均分子质量的增加均高于传统间歇发酵，根据黄原胶发酵液粘度与黄原胶浓 度、平均分子质量间的正相关关系，只有在平均分子质量相近的条件下，黄原胶发 酵液的粘度才会随其浓度的增加而增加。如图4.3所示黄原胶补料分批发酵所得黄原 胶发酵液的粘度远远高于传统间歇发酵所得黄原胶发酵液的粘度。

43 

 

Fig.4.4 Relationship between xanthan gum average molecular weight and fermentation time

正如图4.4所示，黄原胶补料分批发酵所得黄原胶质量明显优于传统间歇发酵所 得黄原胶质量，最终其平均分子质量高达：1.78x1〇7g/mol，而间歇发酵下最终所得 黄原胶平均分子质量分别为：1.36X107 g/mol。黄原胶补料分批发酵和黄原胶间歇发 酵所得黄原胶平均分子量均在其对数生长期结束时达到最大值：1.88407 g/mol、 1.48X107 g/mol，其后随着发酵的进行，黄原胶平均分子质量一直下降，结果与I.S.Suh 和II-Soon Suh的实验结果吻合[3_4]。

4.3.5补料分批发酵工艺对丙酮酸功能基团含量的影响

张禹等研究发现C/N对发酵速度、发酵周期有重要的影响，从对数生长期开始， 采用较高的C/N (大约50: 1)促进黄原胶的合成。同一批黄原胶发酵周期的延长， 丙酮酸含量不断的增加。因此，C/N通过控制生长速度将其作用传递给丙酮酸的合 成[15]。

随着微生物胞外多糖的积累，发酵液中的粘度变得越来越大，当黄原胶浓度超 过20 g/L时，传统间歇发酵下发酵罐的四周开始出现停滞区，停滞区内营养物质和 溶氧的运输几乎停止，导致黄原胶发酵质量下降：平均分子质量下降、分子量分布

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系数增大以及丙酮酸功能基团含量降低，而MB发酵体系中几乎不存在停滞区，因 此MB发酵体系下不论是间歇发酵还是补料分批发酵的整个过程中，都不存在停滞 区。实验结果显示：黄原胶补料分批下发酵所得丙酮酸功能基团含量为4.37%，而传 统的间歇发酵下所得丙酮酸功能基团含量为5.3%。分析其主要原因为：较高的微生 物需要消耗较高的溶氧，而溶氧在发酵过程中对于微生物合成的黄原胶分子中丙酮 酸含量的多少有着直接的关系，同时，黄原胶分子量的增加程度远远高于丙酮酸含 量的增加程度，因此导致间歇发酵中虽然其平均分子质量低，但是其丙酮酸含量高。

M. Papagianni研究表明在发酵的72小时，对于不同搅拌速度（100 r/min〜600 r/min)下，利用HPLC对其丙酮含量测定发现，其随着搅拌速度的提高而增加，众 所周知，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，丙酮酸含量主要依赖菌株和培养基的选择[6]。Peters提出了微生物对氧的需 求和丙酮酸含量两者之间存在着直接的联系：较高的速度将会提高溶氧水平，而丙 酮酸依赖氧的供给，从而解释了在较高的搅拌转速下得到较高的丙酮酸含量[7]。本实 验结果也显示：虽然发酵前期较低的C/N比值可以获得较高的微生物量，但是对于 后期黄原胶分子中的丙酮酸含量却产生一定的影响。

4.3.6补料分批发酵工艺对发酵液中碳源浓度的影响

 

Fig.4.5 Relationship between glucose concentration and fermentation time

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在任何微生物发酵过程中，根据生物反应动力学原理，当发酵液中的底物下降 到一定浓度时，菌体代谢速率非常缓慢，在工业生产中可以结束发酵。黄原胶补料 分批发酵过程中，发酵的刚开始，加入的葡萄糖的量仅仅为22.2 g/L,当微生物生长 繁殖结束的时候（24 h)，一次性流加额外的葡萄糖22.2 g/L。让黄原胶发酵的前期 保持较低的C/N比值，促进微生物的生长，发酵进行到24 h时，即微生物对数生长 期结束，额外流加的22.2 g/L葡萄糖，是发酵液中后期保持了较高的C/N比值，有 利于黄原胶的合成。

如图4.5所示，实验中黄原胶发酵结束时，黄原胶间歇发酵和补料分批发酵中的 葡萄糖含量分别为1.2 g/100mL和0.37 g/100mL。碳源一部分用来构成细胞成分， 一部分维持正常的新陈代谢，另外一部分用于目的产物的合成，补料分批发酵下的 发酵液中残糖含量明显低于间歇发酵下发酵液中残糖的含量，这些一部分用来维持 微生物正常的新陈代谢，另外，就是用来合成黄原胶，正如图4.2所示，补料分批发 酵所得黄原胶产量比间歇发酵所得黄原胶产量高很多。

4.4结论

1、上述实验验黄原胶补料分批发酵，提供了两个合适的环境：一个是微生物生 长，另一个是黄原胶合成，与传统的间歇发酵相比优势更加明显。

2、补料分批发酵前后C/N的变化不仅仅满足了微生物的生长和繁殖，同时提高 了底物碳源的转化率，增加了发酵液中黄原胶的浓度，提高了黄原胶的发酵质量（黄 原胶平均分子质量和丙酮酸功能基团的含量），减少了最终发酵液中碳源的残留量。

3、在MB搅拌体系下，不论是黄原胶补料分批发酵还是间歇发酵都可以可以获 得较高的传质系数、较好的宏观稳定流型，发酵过程中MB体系推动了更大范围的 液体，尤其值得一提的是，MB体系下发酵几乎不存在滞留区，这不仅提高了最终 黄原胶发酵产量，更重要的是提高了黄原胶的发酵质量。

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5总结与展望

5.1全文总结

黄原胶发酵过程的中后期，随着黄原胶浓度的提高，发酵液粘度迅速上升，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，并 体现出强烈的假塑性，造成发酵液传质、传热效率严重下降，并出现混合上的死区。 这种情况的存在影响了黄原胶产品的产量和产品质量，提高了发酵和分离成本，影 响了产品的应用，成为阻碍黄原胶生产技术发展一个必须解决的关键因素。另外， 目前国内黄原胶生产大多采用一次加料的间歇发酵工艺，这种工艺没有考虑发酵过 程中菌体增殖和黄原胶合成两个阶段对底物的不同要求，同样也对最终产品的产量 和质量产生了不利影响。

针对以上情况，本文采用30L机械搅拌式生物反应器，从以下三个方面对黄原 胶发酵过程进行了研究，得出如下结论：

一、研究结果表明，P2DTD+6BM和MB搅拌体系在保持好的径向气体分散能力 的同时，加强了轴向循环混合的能力，明显改善了反应器内部混合状态，具有以下 明显的优点：

1、上述实验验证了冷模实验下的结论：P2DTD+6BM和MB体系具有较高的气 含率和XLa值。

2、在P2DTD+6BM和MB体系下发酵较高的传质系数、较好的宏观稳定流型， 提高了底物淀粉的转化率，增加了发酵液中黄原胶的浓度，减少了最终发酵液中淀 粉的残留量。

3、P2DTD+6BM体系下发酵推动了更大范围的液体，降低了静止区的厚度，尤 其值得一提的是，MB体系下发酵几乎不存在滞留区，P2DTD+6BM和MB体系下不 仅提高了最终黄原胶发酵产量，更重要的是提高了黄原胶的发酵质量（黄原胶平均 分子质量和丙酮酸功能基团的含量）。

二、在上述实验基础上，将MB应用于黄原胶发酵中做进一步研究。利用实验 室30 L发酵罐，在对pH控制的前提下，对黄单胞杆菌XG-101的黄原胶间歇生产和

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生长动力学进行研究，发酵在一系列的搅拌速度（140 r/min〜260 r/min)下进行，结 果显示：

1、随着搅拌转速的增加，发酵动力学各项参数分别增加，同时，黄原胶在发 酵过程中的形成也与微生物的生长有一定的关系。

2、菌体生长曲线随发酵时间不断上升，在36小时，分别进入稳定期，转速为 200 r/min的菌体浓度比转速为140 r/min时的菌体浓度要高，并且随着转速的继续增 加260 r/min时两个相差不再明显。

3、结果也显示随着转速的增加，较高转速下的发酵体系微生物稳定期相对较 长，另一方面也说明较高的转速具有较高的溶氧水平，与华璟薇研究结果一致：发 酵液中的溶氧浓度对菌体生长速率影响不大，但是对菌体浓度达到最大之后的菌体 的稳定期的长短却有着明显的影响。

4、本研究通过新型气体分布器与传统环状分布器的比较发现，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，改进的新型气体 分布器来改变溶氧，使分散出的气体尽可能小，不仅可以延长气体在发酵液中的滞 留时间，同时加大了气液接触面积，从而增加溶氧推动力，这对于反应器内部构件 的优化和黄原胶发酵质量的提高最具有重要的意义，同时，为其他行业中高粘体系 的发酵提供了理论指导和思路。

三、在黄原胶发酵的对数生长期结束阶段，进行了补料分批发酵工艺的研究，并 与一次投料的间歇发酵进行了对比。研究结果表明：

1、实验按照发酵过程的特点，在菌种增殖和黄原胶合成两个阶段分别采用相应 的生长底物，适应了发酵过程的需要，与传统间歇发酵相比，产品质量有了相应的 提高。

2、补料分批发酵前后C/N的变化不仅仅满足了微生物的生长和繁殖，同时提高 了底物碳源的转化率，增加了发酵液中黄原胶的浓度，提高了黄原胶的发酵质量（黄 原胶平均分子质量和丙酮酸功能基团的含量），减少了最终发酵液中碳源的残留量。

3、在MB搅拌体系下，不论是黄原胶补料分批发酵还是间歇发酵都可以可以获 得较高的传质系数、较好的宏观稳定流型，发酵过程中MB体系推动了更大范围的 液体，尤其值得一提的是，MB体系下发酵几乎不存在滞留区，这不仅提高了最终 黄原胶发酵产量，更重要的是提高了黄原胶的发酵质量。

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5.2展望

黄原胶的中后期其发酵液中存在的高粘度、低溶氧，黄单胞杆菌发酵合成黄原胶的工程基础研究，始终是困扰黄原胶生产的 一个问题，间歇法发酵设备主要是生物搅拌反应器，它是目前唯一工业化的设备。 现如今工业上生产黄原胶大都在生物反应器内发酵，因此在黄原胶发酵中后期由于 发酵液的高粘度和强假塑性导致发酵罐内出现大量的死区，不仅造成发酵周期长， 更重要的是导致黄原胶浓度低、能耗高，因此开发新型的适用于黄原胶发酵过程的 新型生物反应器就显得特别重要。

反应器的选择主要是搅拌桨形式的选择，本实验室基于解决上述问题的基础上 研究新的桨型、改变桨型组合层数、并考察反应器内部构件（气体分布器）对黄原 胶发酵的影响，开发适合于黄原胶此类高粘性物系发酵的新型生物反应器，将其应 用于黄原胶发酵中进行实验和检测，同时根据发酵过程中微生物不同时期利用的碳 氮比不同，将MB搅拌体系运用到黄原胶补料分批发胶中来综合研究，不仅仅为提 高黄原胶发酵产量和发酵质量（黄原胶平均分子质量和丙酮酸功能基团的含量）提 供理论指导，更重要的是对开发一种新型的生物反应器提供一定的基础。