随着分子生物学、医学和细胞生物学的快速发展，人们逐渐认识到糖类物质不仅 是能量储存和结构物质的存在形式，也与蛋白质和核酸一样可作为生物信息的载体。 特别是寡糖，它以糖蛋白和糖脂的形式广泛存在于细胞膜的表面，在细胞正常或不正 常的识别过程中都发挥着重要作用[1]。自从Ayer等[2]首次发现寡葡聚糖可诱导大豆产 生植保素后，人们便开始关注寡糖作为植物免疫激活因子的基础研究。由于寡糖安全 无害，能刺激植物的免疫系统产生防御反应，合成具有抗病害的活性物质，黄原胶寡糖生物活性的研究，特别是不 同来源的寡糖可针对不同的病原菌，因此可开发出针对各类病害的系列寡糖农药，解 决基因工程遗传育种也很难解决的病菌生态变异小种的问题[3]。目前己发现具有诱抗 活性的寡糖包括寡聚葡萄糖、寡聚几丁质和寡聚脱乙酰壳多糖等[4]。

在过去的20多年中，有关功能性寡糖方面的研究多集中在海洋性寡糖，如几丁 质、褐藻胶和卡拉胶等制备的寡糖[5]。黄原胶是由Xanhononas aanpestris菌生产的一种胞外多聚阴离子多糖，它以纤维素链结构为碳骨架，每隔一个葡萄糖单位连接一个 线性三糖链[6]。这种结构能使黄原胶形成高度稳定的（a^累旋有序空间结构，因此大 多数微生物都很难将其降解[7]，尽管某些纤维素酶能够部分降解处于无序构型时的黄 原胶[8]。本文以黄原胶降解菌Cellufanoms sp. XT11为研究材料，通过对其胞外降解酶 降解黄原胶为黄原胶寡糖的研究，检测了不同降解程度的黄原胶寡糖的生物学活性。

1材料与方法

1.1黄原胶降解酶的生产

按2%接种量接种黄原胶降解菌Cellulmonas sp. XT11于含有0.3%黄原胶的基础 培养基中，28°C摇床培养（150r/mh) 3d离心（8, 000 r/mh)取上清液为黄原胶降 解酶粗酶液。基础培养基的组成为：0.05%酵母浸粉和0.5%的5种无机盐溶液（5%

CaCl，5%K2HP〇4，8%NaCl 2.5%MgS〇4，7%KN〇3) (JH7.0)。

1.2黄原胶降解酶活力测定

将0.5mL溶解于50mmol/L磷酸缓冲溶液（pH7.0)的0.5%黄原胶溶液和0.5mL

黄原胶降解酶液混合后，40°C水浴保温40m in沸水浴加热5m in终止反应，并测定反 应液的粘度变化。酶活力单位定义为：在上述反应条件下，使黄原胶溶液每下降一个 粘度单位所需要的酶量为一个酶活力单位。

黄原胶寡糖生物活性的研究，粘度采用黄原胶溶液的自然沉降速度表示：取0. 1mL的移液管吸取反应液至满刻 度，记录反应液下降5个刻度所需要的时间（秒)，并以时间“秒”为粘度计量单位。 1.3黄原胶寡糖的制备

将0. 3%的黄原胶溶液和黄原胶降解酶液按9: 1的比例混合后，于40°C水浴中振 荡保温，每隔一定时间取出30mL反应液，沸水浴中加热10m n终止反应后，作为黄原 胶寡糖样品，并分别测定其粘度和还原糖浓度（3 5-二硝基水杨酸法[9])。

1.4黄原胶寡糖的生物活性测定

1.4 1体外清除羟基自由基活性分析：在反应体系中加入0.5mL0. 2m〇l/L磷酸缓冲 液（fH7.5)、0■ lmL 0. 52mg/mL 番红和 0.5mL 2mmol/L 的 EDTANarFe2' 再加入 0.5mL的黄原胶寡糖溶液，用水补足体积为4.9mL，最后加入0.1mL 1%的H2O2溶液， 混匀后于40°C水浴保温30min在波长520nm处测吸光度值OD。空白组以等体积的重 蒸水代替寡糖溶液，对照组以等体积的重蒸水代替寡糖溶液和EDTANa2-Fe2+溶液。实

验结果以清除率E表示：E= (OD样品■〇0空白）x100/ (OD对空白）。

1.42苯丙氨酸解氨酶活性分析：将无菌水浸泡24h的大豆置于铺有滤纸的塑料筐 内，并用湿纱布将滤纸与水源相连。在25°C，光照-黑暗（8h: 16h)交替培养10d左 右，直至大豆长出两片真叶，剪下该两片真叶并用无菌蒸馏水冲洗干净，再用滤纸吸 干。无菌条件下，用刀片削出真叶下表皮厚约1mm，直径约6mm的伤口。去离子水中 浸泡清洗30s后取出，用滤纸吸干水份，放在铺有滤纸的培养皿中，每个培养皿放约 20mg真叶作为一个处理。分别取5UL寡糖液处理每片子叶伤口，并于室温放置6h后， 置于含有0. 1mL甘油、0. 2mL L-半胱氨酸和0.5mL 0.2mol/L硼酸缓冲溶液的混合液 中，冰浴上充分研磨，并振荡浸提5min于10 000 r/mii离心15mi，取0. 2mL上清 液，与0.3mL75mmol/L苯丙氨酸溶液混合，30°C水浴保温30mii，于冰浴中停止反应， 测定OD290。苯丙氨酸解氨酶（PAL)的活力单位定义为：黄原胶寡糖生物活性的研究，上述反应条件下，在30m n 内生成的肉桂酸使OD290增加0. 01个单位所需要的酶量为一个活力单位。

1. 4. 3抑菌活性分析：将野油菜黄单抱菌（Xanthononascampestris)于30mL液体培 养基（1. 5% 葡萄糖，0.3% 酵母膏，0. 2%KH2PO4，0.01% MgS〇4*7H2O)中28°C 摇

床（150r/min)培养24h取培养液分别稀释3 6和30倍后，用300UL均匀涂平板 (1%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%1.7%琼脂），待菌液吸收后用打孔器在每个

平板上等距打5个直径为3mm的孔，做好标记，分别加入15UL的寡糖样品，30°C培 养24h后观察并测定抑菌圈的大小。

2结果与讨论

2. 1黄原胶降解酶的生产

将CelfolOnonassp. XT11菌分别接种于含有0.3%黄原胶、0. 3%葡萄糖、0. 3%黄 原胶并添加0.1% ~ 0.3%葡萄糖的基础培养基中，在28°C摇床中振荡培养（150r/ m in)，定时取样，测定发酵上清液中的黄原胶降解酶活性，结果如图1所示。

 

图1黄原胶降解酶的生产及外源葡萄糖的影响

♦ 0■ 3% xanthan ▼ W ith 0■ 1% glucose，

■ W ith 0■ 2% gUcose，▲ Only 0■ 3% glucose

XT11菌在含有0.双黄原胶的基础培 养基中生长时能够分泌黄原胶降解酶，黄原胶寡糖生物活性的研究，而 在含有0.3%葡萄糖的基础培养基中则不 能合成黄原胶降解酶，说明Cellulonoms XT11合成的黄原胶降解酶应是底物诱导 酶。当在含有黄原胶的基础培养基中添加 不同浓度的葡萄糖时，结果显示外源葡萄 糖的加入会影响Ce1fo1OnonasXT11的产酶 起始时间，说明葡萄糖的加入抑制酶的合 成，只有在外源葡萄糖被消耗后黄原胶诱 导的酶合成才能启动。同时还发现，外源 葡萄糖浓度的増加导致合成酶活力的下降。其它糖类如蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉和 纤维素等与葡萄糖一样，对黄原胶的诱导产酶具有抑制作用。

2.2黄原胶寡糖的生物活性 2.2 1黄原胶寡糖清除羟基自由基的活性：H202在F，存在下可以发生Fenton反应， 生成羟基自由基（• OH): Fe2+ +出02—Fe3+ + • 0H+0H—。

由于羟基自由基能够使番红产生特异性脱色反应，根据番红溶液的脱色程度即可 测定羟基自由基的含量[10]。当在反应体系中加入具有羟基自由基清除功能的被测物时， 部分生成的羟基自由基在与番红发生脱色反应前被清除掉，从而降低了番红溶液的脱 色程度，导致吸光度值的减小程度降低。所以，利用Fenton反应可检测各种自由基清 除剂对羟基自由基的清除能力。取酶水解不同时间的黄原胶寡糖样品分别测定其羟基 自由基的清除能力，结果如表1所示。

表1黄原胶寡糖的生物活性比较

酶解时间（min)501001502⑴250

粘度9176624027

续表1

还原糖（mg/mL)0.0710. 1250. 1610. 1800. 200

粘度还原糖1281. 7608. 0385. 1222.2135. 0

清除率〇)001. 016.97. 2

AE (L)*2.78. 2027. 1/

注解：* A E=苯丙氨酸解氨酶活力寡糖处理样-苯丙氨酸解氨酶活力未处理样

 

黄原胶本身不具有清除自由基能力，但当黄 原胶被降解到某种程度后所形成的黄原胶寡糖，黄原胶寡糖生物活性的研究， 则具有清除羟基自由基的功能，其中，以粘度与 还原末端比为222.2时羟基自由基清除能力最强。 以该寡糖样品为研究材料，考察不同黄原胶寡糖 加量对羟基自由基清除能力的影响，结果如图2 所示。黄原胶寡糖的加样量与其清除羟基自由基 的能力基本成正相关。

图2黄原胶寡糖添加量与羟基自由基2 2.2黄原胶寡糖的激活因子活性：植物防卫反 清除率的关系应中有相当数量的激活因子都是寡糖，很多寡糖作

为激活因子能够诱导植物的非特异性免疫发应，从而启动抵抗病原茵侵袭的植物防御系 统，使植物具有抵抗病原菌侵染的能力。苯丙氨酸代谢途径中的产物如木质素、香豆素、 类黄酮等都具有抑制病原菌的作用，因此该代谢过程中的第一个关键酶苯丙氨酸解氨酶 的活性可作为植物抗病性的重要生理指标。将不同降解程度的黄原胶寡糖样品作用与大 豆子叶后发现（表1)，黄原胶寡糖确实能诱导苯丙氨酸解氨酶活性，且最高酶活性表达 发生在作用后6h左右，说明黄原胶寡糖具有激活植物防卫反应的功能。

2.2 3黄原胶寡糖对野油菜黄单孢菌的抑菌活性：采用上述具有生物活性的黄原胶寡 糖，我们试验了寡糖的抑菌能力，结果发现黄原胶寡糖对E.coli的生长没有影响，但 却能抑制野油菜黄单孢菌的生长，其中以粘度与还原末端比为222. 2的寡糖样品的抑 菌能力最强，抑菌圈可达2 7mm~ 3. Ctom。黄原胶寡糖生物活性的研究，野油菜黄单孢菌是引起油菜发生茎腐病的 致病菌，每年可使油菜减产30%左右，黄原胶寡糖对其抑菌活性的发现，说明黄原胶 寡糖具有潜在的防治油菜茎腐病能力。由上述研究结果说明，黄原胶寡糖确实具有生 物活性，本文仅对黄原胶寡糖的部分生理活性做了初步研究，还有待今后详细研究黄 原胶寡糖的结构与生物活性间的相互关系及其它可能的生理功能。